Triphenylpyridine Derivatives Inhibit Topoisomerase IIα and Induce Apoptosis in Human Cancer Cells

Abstract

핵 내에 존재하는 토포이소머라아제는 복제, 전사, 재조합, 그리고 염색체의 응축과 같은 다양한 생물학적 과정에서 발생하는 위상 문제를 해결하는데 관여하는 효소로써, 서로 꼬여있는 DNA의 가닥을 자름으로써 문제를 해결한다. 토포이소머라아제는 정상 세포보다 암 세포에서 과발현 되어 있어, 오랫동안 항암제 개발의 타깃으로 이용되어 왔다. 토포이소머라아제는 크게 DNA의 한 가닥을 자르는 토포이소머라아제 Ⅰ과 DNA의 두 가닥을 자르는 토포이소머라아제 Ⅱ의 두 가지 종류로 분류된다. 토포이소머라아제 억제제로는 독성억제제와 촉매억제제의 두 가지 형태가 있으며, 대표적인 토포이소머라아제 Ⅰ의 독성억제제로는 camptothecin이 있고 토포이소머라아제 Ⅱ의 독성억제제로는 etoposide가 있다. 독성억제제는 DNA와 토포이소머라아제의 절단복합체를 안정화시키기 때문에 토포이소머라아제의 활성을 억제시킬 뿐만 아니라 DNA 손상을 일으킨다. 비록 독성억제제가 다양한 암 치료에 있어서 효과적으로 암세포를 죽이지만, DNA 독성으로 인한 부작용 때문에 한계를 가지고 있다. 반면에 촉매억제제는 절단복합체 안정화를 제외한 다른 기전으로 작용하는 억제제로, 독성억제제보다 DNA 손상이 적어 그로 인해 야기되는 부작용이 적다. 그렇기 때문에 효과적인 항암제 개발에 있어, 토포이소머라아제를 타깃으로 하는 새로운 기전의 약물로써 강력한 촉매억제제 개발의 필요성이 제기되고 있다. 본 연구에서는 촉매억제제 개발을 위하여 화합물의 토포이소머라아제의 억제 활성을 확인하고 그 작용 기전을 규명하고자 하였다. 영남대학교 이응석 교수님으로부터 triphenyl pyridine의 유도체 27개의 화합물을 제공받아 화합물들의 토포이소머라아제 Ⅰ과 Ⅱ에 대한 활성 억제 효과와 3가지 인간 암 세포 주에서 세포 독성을 확인하였다. 27개 화합물 중에서 가장 강한 토포이소머라아제 Ⅱ에 대한 억제 활성을 보인 AK1-16과 AK1-26을 후보 물질로 정하였으며, 각각 대장암 세포와 유방암 세포 주에서 강한 세포 독성을 확인하였다. 두 가지 후보물질에 대한 토포이소머라아제 Ⅱ 억제 기전을 규명하기 위해서, kDNA decatenation assay, comet assay, competitive displacement assay, band depletion assay, cellular topoisomerase-relaxation assay, 세포기반의 실험인cell vitality assay, cell cycle analysis 그리고 western blot을 이용하여 연구를 수행하였다. 실험 결과를 통해 AK1-16과 AK1-26은 모두 DNA에 끼어들기 약물로 작용하지 않으면서 각각 대장암 세포와 유방암 세포 내에서 G1 arrest를 일으키고 세포 사멸을 유도하는 토포이소머라아제 Ⅱ 촉매억제제로 작용함을 확인하였다.;DNA topoisomerases are essential enzymes that disentangle DNA during DNA replication, recombination, transcription, chromosomal condensation and segregation. They solve the topological problems by causing single- or double-strand breakage in DNA. Taking important roles in diverse biological processes, topoisomerase has long been one of the most fascinating targets of anticancer treatment. Topoisomerase inhibitors are classified into two groups; topoisomerase poisons and catalytic inhibitors. Topoisomerase poisons cause DNA breaks and stabilize DNA-topoisomerase cleavage complex by preventing DNA religation in following steps. However, poisons have limitation because of severe side effects resulted from their DNA toxicity, even though poisons show potent anticancer activities clinically. Catalytic inhibitors are related to the steps other than the stabilization of DNA-topoisomerase cleavage complex in the topoisomerase catalytic cycle. Because catalytic inhibitors inhibit topoisomerase activity without DNA damage, they have less side effects than poisons and can be a good strategy to target topoisomerases. In this study, series of compounds with core-structure of dichlorophenyl pyridines were evaluated for their biological activities using topoisomerase relaxation assay and cell proliferation assay in several types of human cancer cell lines. Among the tested synthetic compounds, two compounds, AK1-16 and AK1-26, were selected as candidates for further study. They showed the most potent topoisomerase inhibitory activities and anti-proliferative activities in each HCT15 and T47D human cancer cells. The mode of action of AK1-16 and AK1-26 was identified using diverse assay methods such as DNA cleavage complex assay, DNA decatenation assay, comet assay, competitive displacement assays, band depletion assay, cellular topoisomerase-relaxation assay and cell-based assays including cell vitality assay, cell cycle analysis, and western blot analysis. Finally, it was revealed that the two compounds were potent topoisomerase II catalytic inhibitors and induced G1 arrest and apoptosis in human colon and breast cancer cells.