Effects of Ramulus mori ethanolic extract ameliorate insulin synthesis in db/db mice through β-cell intoxification

Abstract

Diabetes mellitus with hyperglycemia is one of the most common metabolic disorders characterized by appearing from pancreatic β-cell dysfunction or insulin resistance. Hyperglycemia leads to failure of maintaining homeostasis with leptin and insulin, and results in generating oxidative stress. Previous studies showed that some components of food might have a potential to attenuate pancreas β-cell dysfunction by various mechanism. Ramulus mori has been used as an antioxidant material in Korea. This study investigated the antioxidant and anti-diabetic effects of Ramulus mori (Twig of mulberry extract, TE) and its most powerful antioxidant compound, Oxyresveratrol (OXY) by using db/db mice. Male C57BLKS/J-db/db and C57BLKS/J-m+db mice were randomly divided in 5 groups (n=8 for each group); C57BLKS/J-m+db fed a 10%Kcal fat diet group (CON), C57BLKS/J-db/db fed a 60%Kcal fat diet group (DBCON), C57BLKS/J-db/db fed a 60%Kcal fat diet and TE at a dose of 800 mg/kg B.W. (Twig 1), 1600 mg/kg B.W. (Twig 2) and Oxyresveratrol at 800 mg/kg B.W. (OXY). TE or OXY were given by oral gavage for 14 weeks and their fasting blood glucose was detected every second week. The fasting blood glucose level was significantly decreased in Twig 2 group compared to DBCON group at 12 week (p=0.034). In addition, comparing to DBCON group, improvement of inflammation in TE and OXY treated groups was measured by H&E staining in pancreas β-cell. Pancreatic ROS level in TE and OXY treated groups was decreased compared to DBCON group (p=0.0902). PDX-1 (Pancreatic duodenal homeobox 1) expression in pancreas β-cell was detected to confirm the effect of the insulin biosynthesis by TE. According to pancreatic PDX-1 expression, pancreatic insulin, which is regulated by PDX-1 transcription factor, was a little increased in Twig 2 group. TE suppressed production of ROS by blocking glycation, and significantly improved expression of PDX-1 and insulin. Furthermore, remarkable increases of insulin receptor gene expressions were found in liver and adipose tissue. Taken together, these results provide a basis for the use of TE in regulating hyperglycemia by improving pancreas β-cell dysfunction in ROS related oxidation mechanism.;본 연구에서는 유전자 변형 db/db 마우스에 고지방 식이로 고혈당증을 극대화 시킨 모델을 이용하여 상지 주정 추출물 (Ramulus Mori; TE) 섭취로 활성산소와 관련된 산화반응과 당뇨의 개선 효과를 확인하였다. 수컷 C57BL/6j +/db 마우스 (5주령, n=8)를 정상군(CON)으로, C57BL/6j db/db 마우스 (5주령, n=32)을 무작위로 당뇨유발 군 (diabetic control; DBCON), 당뇨유발 상지 저 용량 군 (diabetic + 800mg/kg B.W. TE; Twig 1), 당뇨유발 상지 고 용량 군 (diabetic + 1600mg/kg B.W. TE; Twig 2), 당뇨유발 Oxyres-veratrol 군 (diabetic + 800mg/kg B.W. Oxyresveratrol; OXY) 총 5군이 되도록 나누었다. CON 군은 지방 10%Kcal 함유 식이를, 당뇨유발 군들은 지방 60%Kcal 함유 식이를 주었고, TE와 그 단일 물질인 Oxyresveratrol (OXY)은 첫째 주부터 희생 전 까지 경구투여 하였다. 실험 기간 내에 2주 간격으로 공복혈당을 측정하였고, Twig 2 군에서 12주 차에서 DBCON군과의 유의적인 차이를 보였다. 14주 간의 고지방 식이 및 당뇨는 조직병리검사에서 CON군에 비해 DBCON군의 췌장에 더 많은 염증과 비대해진 랑게르한스 섬의 크기 변화를 확인 할 수 있었다. 이러한 변화는 TE와 OXY 섭취로 인해 약간 감소 한 것을 확인 할 수 있었다. 또한, 췌장의 활성산소를 측정 해 본 결과, CON군보다 DBCON군에서 유의적으로 수치가 증가한 것을 확인할 수 있었고, 통계적인 차이는 보이지 않았지만 시료 섭취 군에서 그 수치가 감소하는 경향을 보였다. 이를 통해 당뇨에 의해 췌장의 비정상적인 기능이 유발되었고, TE와 OXY의 섭취로 이에 대한 개선 효과를 확인 하였다. 췌장의 활성산소는 잉여 포도당의 대사과정에서 생성되는데, 이러한 활성산소의 과 생성 원인을 포도당의 당화반응이라고 가정하고, TE와 OXY를 포함한 용액의 당화반응 정도를 측정하였다. 그 결과 두 시료의 고 용량에서 모두 당화반응이 억제되는 것을 확인하였다. 인슐린의 생합성은 췌장의 베타세포에서 유전자의 전사과정에서부터 조절된다. 여기에 관여하는 PDX-1라는 전사인자의 단백질 활성은 CON군에 비해 DBCON군에서 유의적으로 감소하였고 TE와 OXY섭취군에서 유의적으로 증가하였으며, 최종적으로 췌장 내의 인슐린 수치 또한 이와 비슷한 결과를 가져옴으로써 TE와 OXY가 잉여 포도당의 당화반응을 억제하면서 감소된 활성산소가 인슐린의 생합성에까지 영향을 미친 것으로 보인다. 췌장에서의 인슐린 수치 변화와 관련하여 인슐린 감수성에 대한 TE와 OXY의 영향을 확인하기 위해, 지방과 간, 그리고 근육에서의 인슐린수용체 mRNA 발현을 측정하였다. 지방과 간에서는 CON군과 비교하여 DBCON군에서 유의적으로 감소하였고, 시료 투여 군에서는 그 수치가 CON군까지 미치지는 못했지만, 유의적으로 회복하는 경향을 보였다. 이러한 결과는 당뇨로 인해 췌장의 베타세포가 제 기능을 하지 못하였을 때, 고 용량의 상지추출물 섭취가 잉여 포도당의 당화반응을 줄이고, 활성산소를 감소시켜 인슐린 생합성에 관여하는 전사인자를 증가시키고 최종적으로 인슐린의 생합성까지 증가시켜 췌장의 기능을 개선하는 역할을 기대할 수 있음을 시사한다.