세라마이드 합성 억제 약물이 간세포 분열과 사멸에 미치는 영향

Abstract

푸모니신 B1(Fumonisin B1, FB1)은 곰팡이에 의해 생성되는 독성물질(mycotoxin)로 주로 콩팥과 간에 손상 및 세포분열을 유발한다. 그에 따른 관련 기전 중 하나로는 세라마이드 합성효소를 억제하는 것으로 보고된 바 있다. 본 연구에서는 FB1으로 유발된 손상 및 세포분열과 관련된 1)자가포식현상과 2)세포주기(cell cycle)조절 기전을 규명하고자 했다. C57BL/6 생쥐에 FB1을 2.5, 5, 10, 20mg/kg/day용량으로 5일간 복강 내에 주사하였고, 간 조직을 적출하여 면역조직화학법, 단백질 분석 및 전자현미경으로 미세구조 변화를 관찰하였다. FB1을 투여한 생쥐의 혈액에서 간 기능의 지표인 AST와 ALT는 대조군 (83±23.09U/L, 27±13.95U/L)에 비해 10mg(140±51.68U/L, 94.5± 62.23U/L)과 20mg(203±75.51, 208.83±87.72)에서 유의하게 증가하였다(p<0.05). 하지만 저용량인 2.5mg과 5mg에서는 증가하지 않았다. 형태학적 변화로는 간세포에서 다수의 공포(vacuole)와 세포분열 그리고 국소적인 괴사성 결절 (necrotic nodule)이 관찰되었다. 자가포식현상에 관여하는 분자들인 LC3Ⅰ/Ⅱ, Atg3, Atg5, Beclin-1, Atg16L1은 FB1 2.5mg과 5mg에서 유의하게 증가한 반면 FB1 10mg과 20mg에서는 증가하지 않았다. LC3Ⅰ/Ⅱ는 대조군에서 염색성(immune reactivity)이 발현되지 않았고, FB1 5mg군에서는 다수의 공포가 있는 간세포 내에서 자가포식소체(autophagogome)로 보이는 세포 내 구조물 내에 위치하였다. 하지만 FB1 20mg군에서는 관찰되지 않았고 다수의 세포괴사가 관찰되었다. 전자현미경으로 관찰한 결과 대조군에 비해 FB1 5mg투여 군에서 이중막 구조로 싸여진 소포(vesicle)내에 조각난 세포소기관들이 다수 관찰되었으며 일부 소포체는 용해소체(lysosome)와 융합되는 과정이 관찰되었다. 또한 괴사된 세포에 인접한 세포 속에 크기가 다소 큰 세포 조각들이 탐식된 거대자가포식(macroautophagy)현상도 관찰되었다. 하지만 과용량인 20mg에서는 세포괴사가 진행되어 세포막을 포함한 세포소기관들 전체의 형체가 불분명해지는 것을 관찰하였다. FB1은 간세포 손상에 보상적인 작용으로 세포분열이 유발되었으며, 저용량인 2.5mg부터 관찰되었다. 세포분열에 관련된 세포주기 조절인자인 Cyclin D1, Cyclin D3, CDK2, CDK4, CDK6은 FB1투여군에서 증가하였다. 이와 대조적으로 세포주기 억제인자인 P27Kip1, P18INK4C은 감소하였다. 흥미롭게도, P27Kip1은 FB1 투여군에서, 세포핵에서 세포질로 이동하는 것을 확인하였다. 결론적으로 간세포에서 FB1이 자가포식현상에 관여하는 유전자를 활성화함으로써 자가포식을 유발하고, 일부 간세포에서 손상에 의한 보상적인 작용인 세포증식은 사이클린 의존성 단백질 (cyclin-dependent kinase, CDK)과 사이클린 의존성 단백질 억제제(CDK inhibitor)의 발현량과 세포 내 발현위치가 중요하다는 것을 알 수 있었다.;Fumonisin B1 (FB1) is an environmental toxin produced by Fusarium molds. Experimental animal studies have indicated that FB1 induces tissue damage and compensatory cell proliferation in the liver. FB1 inhibits ceramide synthase, which is a key enzyme in the generation of sphingolipids. The purpose of this study was to examine the effects of autophagy and expression of CDKs and CDK inhibitors in FB1-treated liver. C57BL/6 mice were divided into 5 groups and received FB1 (0, 2.5, 5, 10, and 20mg/kg/day, i.p) for 5 days. Liver tissues were processed for immunohistochemistry and immunoblot analysis. Low-dose FB1 (2.5 and 5mg/kg) did not affect serum AST and ALT levels. However, high-dose FB1 (10 and 20 mg/kg) significantly increased AST serum levels and caused extensive liver necrosis. Immunohistochemistry detection of LC3Ⅰ/Ⅱ immunoreactivity was mainly detected in the autophagosome membranes in low-dose group. However, Autophagosomes were not observed in high dose group. Expression of LC3Ⅰ/Ⅱ, Atg3, Atg5, Atg16 and beclin-1 significantly increased in low dose group. Electron microscopy showed several autophagosomes and lysosomes in the low dose groups whereas autophagosomes were not observed in high dose group. Immunohistochemical detection of PCNA and quantification revealed that cell proliferation increased by 1.9-fold(2.5mg/kg), 3.6-fold (5mg/kg), 4.5-fold(10mg/kg) and 4.8-fold (20 mg/kg), respectively, in the liver. Expression of CDK2, CDK4, and CDK6 significantly increased in both low-dose and high-dose FB1 groups. Also, expression of CDK associated cyclins (D1 and D3) increased in both FB1 groups. Confocal microscopy showed that CDK2 was co-localized with PCNA in the nucleus of many hepatocytes. In contrast, expression of P18INK4C and P27KIP1 significantly decreased in both low-dose and high-dose FB1 groups. Interestingly, localization of P27Kip1 shifted from the nucleus to the cytoplasm in the liver. These results suggest that expression of autophagy regulated genes and cellular localization of CDKs and CDK inhibitors may play an important role in FB1-induced cell proliferation and cell survival in the liver.