Escherichia coli의 AcrR 기능 규명과 Gluconobacter oxydans의 C3-kinase 특성

Abstract

Acriflavine resistance regulator AcrR is a local transcription factor that regulates the expression of the acrRAB genes associated with the AcrAB-TolC multi-drug efflux pump. Lee et al., 2014 showed that overexpression of AcrR increased cell growth in the presence of n-hexane/cyclohexane. And that AcrR repressed the transcription of marRAB and soxRS, in addition to its own gene cluster acrRAB by direct binding. In this study, the effect of AcrR on gene expression was studied by DNA microarray with the wild type vs △acrR. In the ΔacrR strain, expression of 184 genes was >2.5 increased, which were grouped into seven functional categories: flagella, metabolism, regulator, chaperone, transporter, information transfer and the others. Gluconobacter oxydans, an obligatory aerobic acetic acid bacterium, has several membrane-bound dehydrogenases, which incompletely oxidize a variety of sugar, sugar acid and sugar alcohol including glycerol. This characteristic ability of G. oxydans has been used in several biotechnological processes. In this work, gene knock-out system for was established, by which a gox2222-deleted mutant strain was constructed. The gox2222 encodes a putative kinase in glycerol or dihydroxyacetone metabolism. The gox2222 mutant could not consume glycerol at all, but growth on glycerol increased highly. The expression of genes related to possible glycerol metabolisms and membrane-bound dehydrogenases was studied with Real-time PCR. In the gox2222 mutant, the expression of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, glycerol uptake protein, and glycerol kinase decreased significantly. A gene encoding membrane-bound dehydrogenase, polyol dehydrogenase showed lower expression in gox2222 mutant during growth on glycerol compared. Besides, the gene encoding a PQQ-dependent dehydrogenase 4 showed relatively higher expression level in wild type G. oxydans, during growth on glycerol.;본 논문은 두 가지 주제를 가진다. 첫 번째 부분에서는 E. coli의 조절자인 AcrR에 대하여 그리고, 두 번째 부분에서는 G. oxydans의 C3-kinase에 대하여 연구하였다. 인간 생활에 이용되는 대부분의 유기용매는 석유로 생산되고 있다. 석유고갈의 시대에도 안정적으로 유기용매를 획득하기 위한 연구가 전 세계적으로 이루어지고 있다. 그 대체 방법 중, 미생물 공정을 통한 유기용매 생산은 매우 좋은 대안으로 꼽힌다. 이에 따라 미생물을 이용한 유기용매 생산에서 유기용매내성(Organic Solvent Tolerances)이 중요한 이슈로 떠올랐다. 염색체 사에서 바로 이웃하는 다제내성 펌프인 AcrAB의 발현을 조절하는 local regulator로 알려져 있던 AcrR이 최근 연구 결과 AcrAB의 발현 외에 soxS와 marR의 조절자로 작용을 한다는 사실이 밝혀졌다. 그렇다면 AcrR이 이들 외에 또 다른 유전자의 발현도 조절하는지를 알아보기 위하여 DNA microarray를 진행하였다. E. coli BW25113 wild type과 ΔacrR 균주를 비교하였을 때, 2.5배 이상 증가를 보인 유전자의 개수는 184개였으며, 이들을 7개의 카테고리로 나눌 수 있었다. 대부분의 flagellar 유전자의 발현이 증가하였고, 14개의 조절유전자의 발현이 증가하였다. Gene cluster 단위로 정리하였을 때, paa, mgl, dsd, nan, lld cluster의 발현이 2.5배에서 16배 가량 증가하였다. 이들의 유전자 발현의 변화 중, AcrR의 직접적 결합으로 발현이 조절되는 유전자를 찾기 위하여 Chromatin Immunoprecipitation을 진행하였다. 두번째 부분에서는 의약품이나 정밀화학물질의 원료로서 사용 가능성이 높은 DHA를 생산 하는 산업적 균주인, G. oxydans의 C3-kinase에 대하여 다루었다. G. oxydans는 불완전 산화를 통하여 여러 유용한 물질을 합성해 내므로, 산업적으로도 효용성이 높은 균주이다. 본 연구에서는 G. oxydans의 유전자 knock-out system을 개발하고, DHA 대사에 관련된 C3-Kinase(gox2222) 결실 균주를 제작하였다. gox2222- 균주는 성장이 크게 증가하였으나, 배지에 공급한 탄소원의 소모는 적었다. Real-time PCR 결과 gox2222- 균주는 글리세롤 배지에서 글리세롤 관련 유전자의 발현과 membrane-bound dehydrogenase의 발현이 감소하였다. Gox2222의 기능을 알아보기 위해 kinase assay를 진행하였고, 이를 통해서 Gox2222는 DHA를 기질로 하는 효소임을 확인 할 수 있었다.