Deletion of DGF5 and Overexpression of OLE1 Enhance Stress Tolerance in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Saccharomyces cerevisiae as widely-used microorganism in industry and biotechnology, deals with changes of environment during the cell growth that leads to stress conditions. The HOG and CWI pathway, the two of mitogen activated protein kinase (MAPK) involve in the adaptation and survavibility of this organism which include morphology, physiology, molecular and cellular mechanisms. In chaper 1, the protein product of S. cerevisiae DFG5 gene is a glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored plasma membrane protein and a putative glycosidase/glycosyltransferase that links other GPI-anchored proteins to β-glucans in the cell wall. Upon exposure to heat (41°C), DFG5 deletion mutant dfg5Δ displayed significantly enhanced heat tolerance as well as lowered level of reactive oxygen species and decreased membrane permeability compared with those in the control (BY4741). Comparative transcriptome profiles of BY4741 and dfg5Δ revealed that 34 and 27 genes were up- and down-regulated in dfg5Δ respectively. Of the 27 down-regulated genes, 11 of 13 viable deletion mutants were identified to be tolerant to heat, suggesting that the down-regulation of those genes might have contributed to the enhanced heat tolerance in dfg5Δ. Deletion of DFG5 caused slight activation of mitogen-activated protein kinases Hog1 in the high-osmolarity glycerol pathway and Slt2 in the cell wall integrity pathway. Therefore, a model is proposed on the signal transduction pathways associated with deletion of DFG5 upon heat stress. In chapter 2, Previously, it was found that the mRNA level of OLE1 increases significantly in S. cerevisiae cells exposed to acetic acid. OLE1 encodes the sole and essential Δ-9 desaturase that catalyzes the conversion of saturated to unsaturated fatty acids. When OLE1 was ectopically overexpressed in S. cerevisiae, a significant increase in the oleic acid content of membranes was observed. Compared with control, an OLE1-overexpressing strain displayed better proton efflux, lower membrane permeability and lessened internal hydrogen peroxide content, and enhanced tolerance to various stresses. The enhanced stress tolerance was considerably diminished when OLE1 was overexpressed in a strain deleted for HOG1, which encodes the mitogen-activated protein kinase (MAPK) Hog1 of the high osmolarity glycerol (HOG) pathway, demonstrating its Hog1 dependency. We further found that OLE1 overexpression constitutively activates Hog1, which remains in the cytoplasm. This Hog1 activation was accomplished through the MAPK kinase kinase (MAPKKK) Ssk2, but not through Ste11 and Ssk22, the other MAPKKKs of the HOG pathway. Despite its cytoplasmic location, activated Hog1 was able to activate the expression of its canonical targets such as CTT1, HSP12, and STL1, and further the cAMP response element and stress response element present in the promoter. On the other hand, OLE1 overexpression neither caused nor relieved the endoplasmic reticulum stress. Individually or in combination, the physiological and molecular changes caused by OLE1 overexpression may contribute at least in part to enhanced tolerance to various types of stress.;1. 산업과 생물기술 개발에 널리 사용되는 미생물인 Saccharomyces cerevisiae는 스트레스 환경에서 성장하는 동안 환경변화에 대처 할 수 있다. Mitogen activated protein kinase (MAPK)인 HOG 와 SLT2 경로는 Saccharomyces cerevisiae의 형태학, 생리학, 분자 및 세포 메커니즘을 포함하는 적응과 생존에 관련된다. 2. 1장에서, S. cerevisiae의 DFG5 유전자의 단백질 생산물은 glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored plasma membrane 단백질과 세포벽에서 β-glucans에 연결되어있는 다른 GPI-anchored 단백질인 putative glycosidase/glycosyltransferase이다. 고온(41°C) 스트레스 하에서, DFG5 결손 유전자인 dfg5Δ는 대조군(BY4741)과 비교 했을 때 상당히 향상된 고온 저항성을 보였다. 또한 활성 산소 종의 정도가 낮아지고 막 투과성이 감소되었다. BY4741과 dfg5Δ의 전사체 분석 비교 결과, dfg5Δ에서 38개 up-regulated 유전자와 23개 down-regulated 유전자가 밝혀졌다. 23개 down-regulated 유전자 중, 13개의 생존 가능한 결손 변종에서 11개의 결손 변종은 고온 저항성을 가지는 것을 확인했다. 이는 dfg5Δ에서 이 유전자들의 down-regulation은 향상된 고온 저항성의 원인이 될 것이라고 예상 할 수 있다. DFG5의 결손은 각각 high-osmolarity glycerol 경로, cell wall integrity 경로의 mitogen-activated protein kinases인 Hog1와 Slt2의 약간의 활성을 야기한다. 그러므로, 이 모델은 고온 스트레스 하에서 DFG5의 결손은 신호전달경로에 관련 있다는 것을 제안한다. 2장에서, S. cerevisiae 세포가 아세트산에 노출되면 OLE1의 mRNA 발현 양이 상당히 증가하는 연구 결과가 발표되었다. OLE1은 포화지방산에서 불포화 지방산으로의 전환을 촉매 시키는 단백질인 sole and essential Δ-9 desaturase을 암호화 한다. S. cerevisiae에서 OLE1이 비 정상적으로 과발현이 될 때, 세포막에서 oleic acid 함량이 상당히 증가하는 것이 관찰 되었다. 대조군과 비교 했을 때, OLE1-과발현 균주는 더 좋은 양성자 유출, 낮은 막 투과성, 적은 양의 내부 과산화 수소 함량, 다양한 스트레스에 강화된 저항성을 보여준다. High osmolarity glycerol (HOG) 경로에서, MAPK인 Hog1 단백질을 암호화 하는 HOG1이 결손 된 균주에서 OLE1이 과발현 되었을 때, 강화된 스트레스 저항성은 상당히 감소된다. 이는 이 균주의 Hog1 의존성을 의미한다. OLE1 과발현은 세포질에 남아있는 Hog1을 계속적으로 활성화 시킨다는 것을 찾아냈다. Hog1 활성은 MAPK kinase kinase(MAPKKK) Ssk2를 경유하지만, HOG 경로의 다른 MAPKKK인 Ste11과 Ssk22은 경유하지 않는다. Hog1이 세포질에 위치해 있음에도 불구하고, 활성화된 Hog1은 잘 알려진 목표대상인 프로모터에 존재하는 CTT1, HSP12, STL1, cAMP response element, stress response element의 발현을 활성화 시킬 수 있다. 반면에 OLE1 과 발현은 소포체 스트레스를 유발하지도 않고 과발현 시키지도 않는다. OLE1 과 발현에 의한 개별적 또는 합동적인 생리적, 분자적 변화는 다양한 스트레스에 의한 강화된 저항성을 기여한다고 여겨진다.