C24:1 ceramide release, a marker lipid for eye irritation of surfactants in 3D human corneal epithelial model, MCTT HCE™

Abstract

Due to the invasive and painful experimental procedure of rabbit draize eye irritation test, alternative in vitro test methods replacing it are being actively sought for. Recently, 3D reconstituted human corneal models garner huge attention since they provide with morphological and physiological similarity to human cornea. These models are employing tissue viability as a principal endpoint to determine eye irritants but additional biomarkers are necessary to improve test performance. Here, we explored new lipid biomarkers for eye irritation in 3D human corneal epithelial model, MCTT HCETM. Three irritants; sodium lauryl sulfate, benzalkonium and triton X-100 were selected to encompass anionic, cationic and non-ionic surfactants. After treating MCTT HCETM with irritants, we examined alteration of lipid in corneal tissues with Nile red staining, which revealed considerable depletion of epithelial lipids by eye irritants. We further quantitated ceramides and fatty acids, major lipid components in cornea released into the supernatant employing UPLC/MSMS method to identify lipid markers specific for eye irritants. Among diverse fatty acids and ceramides, nervonoylceramide (C24:1Cer) was found to be significantly and reproducibly released by all three eye irritants in a dose-dependent manner. Further examination of the genes involved in the metabolic pathway for C24:1Cer revealed that the synthesis of C24:1Cer might be stimulated by eye irritants, probably to compensate its loss. These results suggest that C24:1Cer can be novel biomarkers for eye irritants.;전통적인 안자극 시험법인 Draize 토끼눈 시험법은 실험동물인 토끼에서 심각한 고통과 불편을 주기 때문에 이를 대체할 수 있는 시험법이 필요하다. 최근에는 사람 각막과 형태학적 조직학적으로 매우 비슷하도록 3차원적인 인공각막 모델을 개발하여 안자극을 평가하는 시험법들이 국제적으로 많이 개발되고 있다. 인공각막 모델을 사용하는 시험법들은 대부분 조직 생존율을 유일한 안자극 평가 지표로 사용하고 있다는 단점이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위해서 안자극 생체 지표 개발이 필요하다. 그래서 본 연구에서는 한국에서 개발한 인공각막 모델인 MCTT HCETM을 가지고 새로운 지질 생체 지표를 찾는 연구를 진행 하였다. 먼저 안자극 물질로 알려진 계면활성제의 3가지 종류를 대표하는 물질인 sodiumlaurylsulfate, benzalkonium chloride, tritonX-100 을 선택하여 인공각막에 처리한 후 인공각막의 지질 변화를 Nile red 염색을 통해 확인 하였고 구체적인 지질의 변화를 알아보기 위해 LC/MSMS를 통해 배지로 흘러 나온 지질의 양을 음성대조군인 PBS를 처리한 군과 비교하였다. 그 결과 C24:1 ceramide라는 지질의 양이 3가지 안자극 물질 모두에 의해 유의하게 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. C24:1 ceramide의 증가 기전을 찾기 위해 인공각막 조직에 지질 변화를 관찰하고 C24:1 ceramide을 합성에 관여하는 효소의 발현을 real time PCR을 통해 확인한 결과 안자극 물질에 의해 인공각막의 구성성분인 C24:1 ceramide은 약간 줄어들고 배지로 흘러나온 C24:1 ceramide은 현저하게 증가하였다. 또한 C24:1 ceramide합성을 조절하는 효소인 ELOVL1이 증가하였다. 이러한 일련의 결과를 토대로 C24:1 ceramide을 안자극 을 평가할 수 있는 새로운 지질 생체 지표로 제안 할 수 있다.