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dc.contributor.advisor배윤수-
dc.contributor.author안은정-
dc.creator안은정-
dc.date.accessioned2016-08-26T04:08:06Z-
dc.date.available2016-08-26T04:08:06Z-
dc.date.issued2015-
dc.identifier.otherOAK-000000111179-
dc.identifier.urihttps://dspace.ewha.ac.kr/handle/2015.oak/211908-
dc.identifier.urihttp://dcollection.ewha.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000111179-
dc.description.abstractPreviously we identified that SH3 domain containing YSC84-like 1 (SH3YL1) protein interacts and activates NADPH oxidase 4 (Nox4). However, the molecular mechanism by which Nox4-SH3YL1 axis induces ROS generation and cell migration is not well known. To identify whether SH3YL1 protein regulates downstream cell signaling leading to cell migration, I performed yeast two-hybrid assay using SH3YL1 (AA 2-285) as a bait in human kidney cDNA library spreading on selection medium (SD-leucine, tryptophan, uracil). I identified seven real positive clones (SH3D19, Grb2, NPHP3, RGNEF, RANBP9, ATP1B1, and ATP1B3). Co-immunoprecipitation assay was performed to identify whether SH3YL1 binds with RGNEF in response to LPS. An immunoblot analysis of the resulting immune complex revealed that SH3YL1 interacted with RGNEF and their interaction was increased in response to LPS. To validate the interacting domain of RGNEF with SH3YL1, we transfected wild type RGNEF, RGNEF-C (AA 1220-1700), and RGNEF-ΔFAK (AA 1374-1700) into HEK293T cells. RGNEF-ΔFAK failed to interact with SH3YL1, indicating that FAK domain of RGNEF is responsible region for interacting with SH3YL1. We evaluate whether the function of RGNEF is involved in LPS-mediated ROS generation. Transfection of dominant negative form of RGNEF into smooth muscle cells (SMCs) resulted in significantly suppressed ROS generation in response to LPS. To confirm the function of RGNEF in ROS generation, we prepared primary SMCs from RGNEF KO mice (RGNEF KO SMCs). Stimulation of RGNEF KO SMCs with LPS failed to induce ROS generation. These results indicate that RGNEF plays an important role in LPS-induced ROS generation. It is wildly accepted that ROS mediate various cellular events such as cell migration. Stimulation of RGNEF KO SMCs or Nox4 KO SMCs with LPS resulted in suppressed cell migration in Transwell migration assay and wound-healing assay. Taken together, SH3YL1-RGNEF complex regulates LPS-induced ROS generation and cell migration.;활성산소종 (Reactive oxygen species)은 유기호흡을 하는 과정에서 발생한다. Free radical을 가져 불안정하며 그로 인한 강한 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이러한 강한 활성 때문에 세포내 독성을 나타내기도 하며 여러 퇴행성질환이나 암, 노화와 강한 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 최근의 연구에서는 활성산소종이 낮은 농도에서는 세포내 신호전달과정에서 2차 신호전달물질 (second messenger)로서 작용한다는 것이 밝혀졌으며 암세포에서 apoptosis를 유발하거나 cell cycle arrest를 일으켜 암세포의 증식을 억제할 수 있다는 것이 밝혀지고 있다. 이러한 양면성 때문에 활성산소종의 생성과 분해에 관련한 메커니즘에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. NADPH oxidase (Nox)는 이러한 활성산소종의 생성에 관련된 효소로서 다양한 유사체가 알려져 있고 이 유사체 들은 구조상 유사하지만 발현되는 조직, 보조인자의 종류, 관련되는 생리학적인 기능 등에서 차이를 보인다. 그 중에서 Nox4에 의한 활성산소종의 생성에는 p22phox가 연관됨이 밝혀진 바 있고 선행연구를 통해 SH3 domain containing YSC84-like 1 (SH3YL1)이 이러한 Nox4와 p22phox와 결합하여 활성산소종의 생성을 돕는 것을 밝힌 바 있다. SH3YL1이 Nox4의 효소활성 조절에 미치는 영향을 조사하는 과정에서 yeast two hybrid를 통해 SH3YL1과 결합하는 7개의 gene을 발견하였으며 이 중에서 p190RhoGEF (Rgnef, Arhgef28)를 target으로 연구를 진행하였다. p190RhoGEF는 Rho guanine nucleotide exchange factor (GEF)로서 Rho family member의 Rho small GTPase protein들을 GDP가 결합된 비 활성 상태 GTP가 결합하도록 하여 활성 상태의 Rho로 바꿔주는 활성을 가지고 있는 protein family이다. GEF는 Rho GTPase의 활성을 증진시켜서 세포증식과 움직임을 조절하는 신호전달경로 (signaling patyway)를 조절한다. Rgnef는 특이적으로 GEF역할을 수행하는 domain 외에 FAK (focal adhesion kinase)과 직접적으로 결합하는 domain이 존재하여 이를 통한 세포이동에도 관련이 있음이 관련 연구를 통해 밝혀지고 있다. 본 논문에서는 쥐의 평활근 세포 (mouse smooth muscle cell)에서 Rgnef가 Nox4에 의한 활성산소종 생성을 증가시키는 것을 확인하였고 이러한 활성산소종의 생성이 Nox4에 의해서 특이적으로 나타나며 RhoA의 dominant negative mutant에 의해 감소하는 것을 확인하였다. 또한 Rgnef에 의한 RhoA activity가 SH3YL1에 의하여 감소하고 LPS 자극이 있을 때 다시 회복되는 것을 확인 할 수 있었다. Wound healing assay와 transwell migration assay를 통해 LPS에 의해 증가하는 쥐의 평활근 세포의 이동이 Rgnef 유전자 결핍 쥐의 평활근 세포와 Nox4 유전자 결핍 쥐의 평활근 세포에서는 관찰되지 않음을 확인하였다. 이를 통해 Rgnef가 SH3YL1과 결합하여 SH3YL1의 Nox4 활성 조절에 영향을 미치고 이것이 결과적으로 세포이동에 영향을 미치는 것으로 생각된다.-
dc.description.tableofcontentsⅠ. 서론 1 Ⅱ. 연구 재료 및 방법 11 1.세포 배양 및 쥐의 대동맥 평활근 세포 분리 11 2. Yeast two hybrid 11 3. Immunoblotting 12 4. RNA 추출 및 RT PCR 13 5. Quantitative RT PCR 13 6. co-immunoprecipitation 13 7. 활성산소 측정 14 8. RhoA activity 측정 15 9. Wound healing assay 15 10.Transwell migration assay 16 Ⅲ. 결과 17 1. SH3YL1과 Rgnef의 결합 17 2. Rgnef가 쥐의 평활근 세포에서 활성산소 생성에 미치는 영향 21 3. Rgnef가 쥐의 평활근 세포에서 활성산소생성에 영향을 미치는 것은 Nox4에 의존적이다 26 4. SH3YL1은 RhoA 활성을 감소시키고 LPS자극에 의해 회복된다 30 5. RhoA DN에 의해 활성산소 생성이 감소한다 32 6. SH3YL1-Rgnef 상호작용은 cell migration에도 영향을 미친다 35 Ⅳ. 고찰 38 Ⅴ. 참고문헌 42 영문 초록(ABSTRACT) 52-
dc.formatapplication/pdf-
dc.format.extent2067542 bytes-
dc.languagekor-
dc.publisher이화여자대학교 대학원-
dc.subject.ddc600-
dc.titlep190RhoGEF와 SH3YL1의 상호작용이 활성산소생성과 세포이동에 미치는 영향-
dc.typeMaster's Thesis-
dc.title.translatedNovel Function of p190RhoFEF in Nox4-mediated ROS generation-
dc.creator.othernameAn, Eun Jung-
dc.format.pagevii, 53 p.-
dc.contributor.examiner이종란-
dc.contributor.examiner이수영-
dc.contributor.examiner배윤수-
dc.identifier.thesisdegreeMaster-
dc.identifier.major대학원 생명과학과-
dc.date.awarded2015. 2-
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