Development of Neuroprotective Agents and Analytical Methods for Antioxidant’s Reactivity and Albumin’s Structural Modifications

Abstract

This study was mainly focused on the development of μ-calpain inhibitors targeting Alzheimer’s disease (AD) treatment. The stability and utility of N-acetlycysteine (NAC) in peritoneal dialysis fluids (PDFs) were also analyzed using various analysis devices such as RP-HPLC and LC-TOF-ESI-MS. Not only that, a new assay method to detect the cobalt-albumin binding affinity named the ‘CAB assay’ was developed, which may detect the conformational change of albumin. μ-Calpain is a calcium-dependent cysteine protease, which is activated by μM concentration of calcium in vitro. Disrupted intracellular calcium homeostasis leads to hyper-activation of μ-calpain. Hyper-activated μ-calpain enhances the accumulation of β-amyloid peptide by increasing the expression level of β-secretase (BACE1) and induces hyper-phosphorylation of tau along with the formation of neurofibrillary tangle by mediating p35 cleavage into p25, both of which are the major mechanisms of neurodegeneration in AD. Hence, inhibition of μ-calpain activity is very important in the treatment and prevention of AD. In this study, Undecylenic acid (UDA), a naturally occurring unsaturated fatty acid, was discovered as a μ-calpain inhibitor by screening a chemical library using a substrate specific μ-calpain assay method. To discover a novel μ-calpain inhibitor, we performed structure activity relationship (SAR) study of UDA derivatives. A variety of naturally occurring unsaturated fatty acid were screened to search for substances with better potency and selectivity for μ-calpain inhibition than UDA. CLA, an eighteen-carbon unsaturated fatty acid, was discovered as a μ-calpain-specific inhibitor. UDA and CLA showed neuroprotective effects against neurotoxins such as H2O2 and Aβ1-42 in SH-SY5Y cells, and inhibited Aβ oligomerization/fibrillation. In addition, UDA and CLA decreased the levels of proapoptotic proteins, p35 conversion to p25 and tau phosphorylation. These findings implicate that UDA and CLA as a new core structure for selective μ-calpain inhibitors had neuroprotective effects. UDA and CLA should be further evaluated for its potential use as an AD therapeutic agent. Cathepsin B (CatB) is also associated with amyloid plaques in AD and selectively cleaves the wild-type β-secretase site of amyloid precursor protein (APP), which results in increased Aβ production. Thus, it is important to inhibit both μ-calpain and CatB as the therapeutic target of AD. To find the novel dual inhibitor, we screened the chalchone analogues. Natural and synthetic chalcones display a wide variety of pharmacological effects, but calpain and CatB inhibitory activity is not yet known. We found that chalcone derivatives, CNa7 and 11 had inhibitory activity of calpain and CatB and confirmed the results by performing the molecular docking studies. In addition, CNa7 and 11 had neuroprotective effects against H2O2-induced apoptosis. Although they need a little more experimental results, CNa7 and 11 are novel non-peptide-like μ-calpain and CatB dual inhibitor with potent neuroprotective effect. We analyzed the reactivity of N-acetylcysteine (NAC) with glucose degradation products (GDPs) and the stability of NAC in peritoneal dialysis fluids (PDFs) using RP-HPLC and LC-ESI-TOF-MS. NAC reduced the amount of 3,4-dideoxyglucosone-3-ene (3,4-DGE), most toxic among GDPs in PDFs by forming NAC-DGE conjugate under nonenzymatic conditions. NAC retained as a reduced monomer form in the high-glucose compartment of dual-chambered neutral-pH type PDF, whereas it easily formed a homo-dimer in an incubation-time-dependent manner in other solutions. The present investigation suggests that NAC can be employed as an adjuvant added into the high-glucose compartment of N-PDFs to reduce GDP-mediated peritoneal membrane failure in patients on long-term PD treatment. Human serum albumin (HSA) is the most abundant protein in human body. HSA injections prepared by fractionating human blood have mainly covered the demand of albumin to treat hypoalbuminemia, the state of low concentration of albumin in blood. Albumin is known to be vulnerable to different pH conditions. Not only that, HSA in solution exists in various forms such as monomers, oligomers, polymers, or as mixtures, and HSA conformational change and/or aggregation occurs easily. Considering these characteristics of albumin, there is a great chance of modification and polymer formation during preparation processes of albumin products, especially injections. The ACB test reported by Bar-Or, et al. was designed to detect ischemia modified albumin (IMA), which contains modified HSA N-terminal sequence by cleavage of the last two amino acids. In this study, we developed the ACB test into a cobalt albumin binding (CAB) assay to overcome the limitations of the already-established test. The changes in the absorbance unit of the CAB assay were validated with liquid chromatography, mass spectrometry, and native gel electrophoresis. The newly developed CAB assay provides information of albumin configuration alterations and will be able to be used to develop quality control methods for albumin injections. This improved, sensitive, and simple assay presents a novel protocol for handling albumin. ;본 연구는 새로운 골격을 가진 비 펩타이드성 μ-calpain 저해제를 개발 한 후 알츠하이머 체료제로서의 가능성을 연구 하였다. 또한, 복막 투석액 제조 과정에서 생성되는 독성이 강한 glucose degradation products (GDPs)를 제거하는 목적으로 항산화제로 잘 알려진 N-acetylcysteine (NAC)을 복막 투석액의 보조제로 사용할 수 있는지를 확인하기 위하여 RP-HPLC와 LC-ESI-TOF-MS를 사용하여 NAC의 안정성과 유효성 테스트를 수행하였다. 뿐만 아니라 알부민과 코발트의 결합력을 측정할 수 있는 새로운 분석법을 개발하여 알부민의 전체적 구조 변화를 감지할 수 있게 되었다. μ-Calpain은 칼슘에 의해 활성화 되는 효소로, in vitro에서 μM 농도의 칼슘에 의해 활성화 된다. 병적 상태나 외부 자극에 의해 칼슘 항상성이 깨지면 μ-calpain이 활성화 되는데 과활성화된 μ-calpain은 β-secretase (BACE1)의 발현을 높여 세포 외부의 β-amyloid peptide의 축적을 유도한다. 또한 CDK5의 활성 조절인자인 p35를 p25로 잘라 p25/CDK5 복합체를 형성함으로써, CDK5의 kinase 활성이 지속적으로 유지되어, AD의 주요 원인으로 알려진 tau 단백질을 과인산화 시켜 neurofibrillary tangle을 만드는데 관여한다. β-Amyloid peptide의 축적과 neurofibrillary tangle은 가장 잘 알려진 AD의 원인으로, calpain이 두 가지 원인 모두에 관여 하고 있으므로, calpain 활성을 저해하는 것은 AD 치료제 개발의 좋은 타깃이 될 것이다. 본 연구에서는 한국 화합물 은행에서 제공받은 화합물을 기질 특이적인 μ-calpain assay를 통해 screening 하여 calpain 저해 활성을 가지는 불포화 지방산 undecylenic acid (UDA)를 찾았다. 구조 활성 상관 관계 연구를 통해 UDA 유도체중 UDA보다 μ-calpain 저해 활성과 선택성이 좋은 conjugated linoleic acid (CLA)를 찾았다. UDA와 CLA는 SH-SY5Y cell에서 H2O2와 Aβ1-42에 의한 세포 독성을 저해하여 신경 보호 효과가 있는 것을 확인하였고, 또 Aβ의 올리고머화와 응집을 저해 효과도 보았다. UDA와 CLA는 세포 사멸이 일어날 때 활성화되는 단백질인 caspase-3와 PARP의 발현 정도를 감소시키고, p35에서 p25로 자르는 것을 감소시키며, tau의 인산화도 저해한다. 뿐만 아니라, CLA는 밀착 연접을 이루는 단백질인 ZO-1의 분해도 저해하며, 분자 모델링을 통해 calpain과의 결합을 확인한 결과, calpain의 active site에 잘 결합 하였다. 이 결과들로 보아, UDA와 CLA는 신경 보호작용이 있는 새로운 구조의 μ-calpain 저해제이며, AD치료제 또는 치료보조제로서의 가능성을 제시 하였다. CatB 또한 APP의 BACE1 절단 부위를 잘라 세포 외의 Aβ의 응집을 증가 시킨다. 그러므로, μ-calpain과 CatB의 동시 저해는 AD 치료제 개발의 좋은 타깃이다. μ-calpain과 CatB 동시 저해제를 찾기 위해, chalcone 유도체를 합성하고, 그 것의 저해 활성을 평가 하였다. 천연 또는 합성 chalcone 화합물은 다양한 약리 활성을 가지는 것으로 알려져 있지만, μ-calpain과 CatB 저해 활성은 아직까지 알려져 있지 않다. Chalcone 유도체들 중, μ-calpain과 CatB를 동시에 저해하는 CNa7과 CNa11 화합물을 찾았고, 분자 모델링을 통해 이 화합물들의 μ-calpain과 CatB와의 결합을 확인한 결과 active site에 잘 결합 하였다. 뿐만 아니라, CNA7과 CNa11은 신경 세포에서 과산화수소에 의해 유도되는 세포 사멸을 저해하는 것으로 보아 신경 보호 효과가 있다고 할 수 있다. 조금 더 많은 실험 결과들이 보충된다면, CNa7과 CNa11은 신경 보호 효과가 있는 새로운 구조를 가진 μ-calpain과 CatB 저해제임을 밝힐 수 있을 것이다. 복막 투석은 만성 신부전 환자들의 치료의 목적으로 사용되며 복막 투석 액을 제조할 때 멸균 시키는 과정에서 glucose 가 분해되어 glucose degradation products (GDPs)가 생성되는데 이는 세포독성이 강해 부작용을 유발한다. 본 연구에서는 항산화제로 알려진 N-acetyl cysteine(NAC)을 복막투석액에 첨가하였을 때 GDPs와 직접 결합하여 GDPs의 독성을 감소시킬 수 있는지 RP-HPLC와 LC-ESI-TOP-MS를 사용하여 분석하였다. NAC은 GDPs 중 가장 독성이 강하다고 알려진 3,4-DGE와 직접적으로 결합하여 NAC-DGE를 형성해 복막 투석액 속의 3,4-DGE의 양을 감소시킨다. NAC의 안정성을 HPLC로 확인한 결과 dual-chambered neutral-pH type 복막투석액의 high-glucose compartment에서 NAC은 단량체 형태로 존재하지만, 다른 compartment에서는 반응 시간에 따라 쉽게 동질 이량체를 이루는 것을 확인 하였다. 이 결과는 NAC을 복막 투석 액의 high-glucose compartment에 첨가 하였을 때 GDPs에 의한 독성을 감소시킬 수 있는 좋은 보조제로서 사용 가능성을 제시 하였다. 알부민은 몸에 풍부하게 존재하는 단백질로 저알부민혈증 증상을 보이는 환자에게 주사제로 사용되고 있다. 알부민은 pH에 따라 다양한 구조적 형태를 갖는다. 사람 혈청 알부민은 단량체, 올리고머, 폴리머 또는 이들의 혼합 형태로 존재하며, 쉽게 응집 된다. 하지만, 알부민의 구조적 특징을 구별 할 수 있는 분석 방법이 아직 개발 되어 있지 않다. Bar-or 그룹에서 허혈 변성 알부민 (ischemia modified albumin, IMA)을 측정하는 방법으로 알부민 코발트 결합 시험법 (Albumin Coblat Binding (ACB) test)을 개발 하였는데, 허혈 상태가 되면, 알부민의 N-말단의 두 개의 아미노산이 잘려져 IMA를 생성 하고, 이로써, N-말단에 결합하고 있던 금속 이온인 cobalt의 결합력이 약해지는 정도를 free cobalt와 결합하는 dithiothreitol (DTT)를 사용하여 측정 하는 것이다. 하지만, 코발트는 알부민의 N-말단에 결합하는 주요 금속이 아니며, 코발트의 주요 결합 부분은 알부민의 다른 곳이라고 알려져 있다. 본 연구에서는, 이미 개발된 ACB test를 기본으로 하여, 새로운 코발트 알부민 결합 시험법 (Cobalt Albumin Binding (CAB) assay)을 개발 하였다. CAB assay는 IMA 뿐만 아니라, 알부민의 전체적인 구조적 변화도 감지할 수 있다. CAB assay는 ACB 보다 더 감도가 좋으며, 사용되는 샘플 양도 줄여 다양한 알부민 연구에 사용될 수 있고, 사람 혈액 샘플, 동물 혈액 샘플에도 적용 가능 하게 되었다. 이 실험방법은 HPLC, LC-ESI-TOF-MS와 negative gel electrophoresis를 통해 검증 하였다. 이 결과들로 보아, CAB assay는 알부민 구조 연구에 유용하게 사용되어, 알부민 주사제의 품질관리에 사용될 수 있을 것이다.