Multi-scale simulation studies of S-Adenosylhomocysteine hydrolase, A₂AAR, and TRPV1 to investigate their domain motion, allostery, and ligand binding

Abstract

Part I. Multi-scale simulation study of the domain motion and allosteric signaling of S-Adenosylhomocysteine hydrolase S-adenosylhomocysteine hydrolase (SAHH), a cellular enzyme that plays a key role in methylation reactions including those required for maturation of viral mRNA, is an important drug target in the discovery of antiviral agents. While targeting the active site is a straightforward strategy of enzyme inhibition, evidence of allosteric modulation of active site in many enzymes underscores the molecular origin of signal transduction. Information of co-evolving sequences in SAHH family and the key residues for functional dynamics that can be identified using native topology of the enzyme provide glimpses into how the allosteric signaling network, dispersed over the molecular structure, coordinates intra- and inter-subunit conformational dynamics. To study the link between the allosteric communication and functional dynamics of SAHHs, Brownian dynamics simulations were performed by building a coarse-grained model based on the holo and ligand-bound structures. The simulations of ligand-induced transition revealed that the signal of intra-subunit closure dynamics is transmitted to form inter-subunit contacts, which in turn invoke a precise alignment of active site, followed by the dimer-dimer rotation that compacts the whole tetrameric structure. Further analyses of SAHH dynamics associated with ligand binding provided evidence of both induced fit and population shift mechanisms and also showed that the transition-state ensemble is akin to the ligand-bound state. Besides the formation of enzyme-ligand contacts at the active site, the allosteric couplings from the residues distal to the active site are vital to the enzymatic function. Part II. Identification of allosteric signaling transduction pathways of A2A adenosine receptor and other GPCRs using network analysis G-protein coupled receptors (GPCRs), the major gatekeeper of extracellular signals on plasma membrane, are unarguably one of the most important therapeutic targets. It has recently been shown that allosteric modulations could be more efficacious in selectively regulating the receptor activity than conventional drugs targeting at orthosteric sites. To gain better insights into the mechanism of receptor regulation, an allosteric wiring diagram of intra-molecular signal transductions would be of great help. Here, by analyzing the graph representation of protein structure, the maps of information flow in GPCRs were calculated, and the key residues for signal transductions and their pathways were identified. Compared with preexisting bioinformatics approach or variants of normal mode analysis, the allosteric hotspots identified using the network analysis for A2A adenosine receptor (A2AAR) and bovine rhodopsin as test systems are in strong correlation with biochemical data from mutation studies and X-ray structures at distinct states. In particular, this analysis precisely identifies the location of rotameric micro-switches, which are deemed critical for mediating orthosteric signal transductions in GPCRs. For A2AAR, by calculating intra-molecular cross-correlation map based on equilibrium structural ensemble from molecular dynamics simulations for the apo and agonist-bound states, it is found that the strong signals of long range transmembrane communications exist in the agonist-bound state. Hierarchical clustering analysis provides a systematic way to identify the groups of cross-correlated residues. A seemingly subtle variation in structure, found in different GPCR subtypes or imparted by agonist bindings or a point mutation at an allosteric site, can lead to a drastic difference in the map of signaling pathways and protein activity. The map of intra-molecular signal transduction elucidated for a given GPCR structure provides valuable insights into allosteric modulations as well as reliable identifications of orthosteric signaling pathways. Part III. Structural studies of TRPV1 and the binding mode analysis of its modulators Transient receptor potential vanilloid subtype 1 (TRPV1) is a non-selective cation channel and mediate a variety of sensations by temperature, touch, pain, osmolarity, taste and other stimuli. This enzyme is activated by noxious heat, low pH, and vanilloid compounds such as capsaicin, the primary pungent ingredient of hot chilli peppers. Since TRPV1 has been shown to be important in both nociception (the perception of pain) and the inflammatory responses, it is considered as a highly validated therapeutic target. The functional TRPV1 is a homotetramer, and the tetrameric homology model of rat TRPV1 (rTRPV1) transmembrane domain was constructed in our lab. In the absence of the X-ray crystal structure of TRPV1, this structural model could be very useful for conceptual understanding of this channel structure and function, and also provides important insights into the ligand-receptor interactions at the molecular level. Here, the binding modes of the newly discovered TRPV1 modulators with diphenylamine scaffolds were investigated through the molecular docking and molecular dynamics simulation studies. In addition, the predicted binding site is confirmed by the mutational studies and bioinformatics approach, such as structure perturbation method and network analysis.;Part I. Multi-scale simulation study of the domain motion and allosteric signaling of S-Adenosylhomocysteine hydrolase S-adenosylhomocysteine hydrolase (SAHH)는 숙주의 세포내 효소로서, 바이러스 mRNA의 성숙에 필수적인 메틸화 반응에 중요한 역할을 하기 때문에 항바이러스제 개발에 중요한 약물표적이다. 이 효소는 리간드 결합에 따라 open form에서 closed form으로 구조적 변화를 수반하며, 효소의 작용 및 기전을 더 깊이 이해하기 위해서는 그 구조변화에 대한 동역학적인 연구가 요구된다. 본 실험에서는 SAHH의 allosteric 신호전달 네트워크를 규명하기 위하여 SAHH 단백질군의 모든 단백질 서열 정보를 수집한 후 통계적 커플링 분석 연구를 수행하였다. 이를 통해 규명된 공진화(co-evolving)하는 클러스터는 효소 단량체 수준에서의 단백질 서열 정보를 바탕으로 얻은 결과임에도, 전체 tetramer에 걸쳐 서로 연결되어 영향을 주고받는 네트워크를 보여주었다. 여기서 규명된 allosteric 네트워크의 주된 요소인 central core channel 부분과 C-terminal 부분은 SAHH의 구조 유지나 그 효소 활성에 중요하다고 보고된 바 있으며, 그 중 R49, C195, K426, Y430 등은 돌연변이 실험 등에 의해 그 중요성이 실험적으로도 확인된 바 있다. 또한, SAHH의 open form과 closed form의 3차원 구조 정보를 이용하여 탄성망 모델을 구축한 후 정규모드분석 연구를 하였고, 이를 바탕으로 구조섭동법 연구를 수행하여 저주파 모드에서 그 functional dynamics에 중요한 영향을 미치는 hot spot 잔기를 규명하였다. 그 결과, open form의 최저주파 모드인 catalytic site 닫힘 모션에 중요한 hot spot은 hinge region에 해당하는 부분이었고, closed form의 최저주파 모드인 dimer 뒤틀림 모션에 중요한 hot spot은 단량체들 사이의 접촉면(interface)에 해당하는 부분임을 알 수 있었다. 앞서 밝혀진 결과를 바탕으로 SAHH의 생체 분자 시뮬레이션을 수행하여 리간드 결합에 따른 구조적 변화를 시간에 따라 분자 레벨에서 연구하였다. 브라운 동역학 알고리즘을 적용하여 리간드 확산에 의한 구조적 변화를 tetramer 수준에서 750 μsec 동안 시뮬레이션 하였으며, 그 궤적의 RMSD를 분석한 결과, 리간드가 결합한 후 open form에서 closed form으로 가까워지는 것을 관찰할 수 있었다. SAHH의 도메인 모션에 대한 자세한 분석 결과, 리간드 결합에 따른 가장 글로벌한 모션은 catalytic domain이 움직여 활성 부위가 닫히는 모션과 두 dimer 사이에 뒤틀림 모션이라는 것이 도출되었으며, 이는 앞서 수행한 정규모드분석에서 밝혀진 최저주파 모드와도 일치하는 결과였다. 더 나아가, 본 연구에서는 리간드 결합 전과 후의 평형 상태에서 주요 아미노산 잔기 사이의 contact probability를 계산하여 어떠한 아미노산 잔기들이 도메인 모션에 영향을 미치는지 분석하였고, 특정 아미노산 잔기 사이의 거리에 대한 키네틱 분석으로 이러한 모션들 사이에 일정한 체계(hierarchy)가 있음을 밝혔다. 이러한 연구결과를 통하여 단백질 내의 서열, 3차원 구조, 동역학적으로 서로 상호작용하는 신호전달체계를 밝혔고, 단백질의 기능을 나타내는 데에는 활성 부위뿐만 아니라 이러한 단백질의 알로스테리(allostery)가 중요한 역할을 한다는 것을 규명하였다. Part II. Identification of allosteric signaling transduction pathways of A2A adenosine receptor and other GPCRs using network analysis G-protein coupled receptor(GPCR)은 생체막에 존재하면서 외부의 다양한 신호를 세포막 안쪽으로 전달하는 데에 필수적인 역할을 하기 때문에 가장 중요한 약물 타겟 중 하나이다. 최근 들어 약물 개발에 있어 단백질의 allosteric 조절기전을 이용하는 것이 orthosteric 사이트를 선택적으로 타겟팅하는 것보다 수용체 활성을 조절하는 데에 더 효과적일 수 있다는 것이 보고되고 있는데, 세포내 신호전달에 대한 allosteric wiring 다이어그램은 수용체 조절 메커니즘에 대한 더욱 깊이 있는 연구를 위해 큰 도움이 될 것으로 생각된다. 본 연구에서는 GPCR의 3차원 구조를 그래프적으로 표현하여 그 네트워크를 분석하였고, 네트워크 상에서의 정보 흐름을 map으로 나타내어 GPCR의 분자내 신호 전달에 중요한 역할을 하는 아미노산 잔기들과 그 경로를 분석하였다. A2A 아데노신 수용체 (A2AAR)와 bovine rhodopsin을 모델시스템으로 이용하여 수행한 네트워크 분석 연구를 통해 이들의 allosteric 핫 스팟을 규명하였고, 기존의 바이오인포마틱스적인 방법들과의 비교분석을 통해 본 연구가 돌연변이 연구 및 X-선 구조 등 생화학적 실험적 데이터와 보다 강한 상관 관계를 보이는 것을 확인하였다. 특히, 본 네트워크 분석연구는 GPCR의 활성화에 중요하다고 알려진 rotameric 마이크로 스위치 잔기들을 상당히 정확하게 예측하였고, apo 상태 및 효현제가 결합된 A2AAR의 분자동역학 시뮬레이션으로 나온 평형 구조 앙상블을 바탕으로 각 아미노산 잔기들의 상관 관계 지도를 계산하여, 효현제가 결합된 경우 생체막을 가로지르는 장거리 상호작용이 존재하는 것을 발견하였다. 이러한 상호작용하는 아미노산 잔기 그룹을 체계적으로 식별하기 위하여 계층 적 클러스터링 분석을 수행하였고, 신호전달경로를 가시화하였다. 이러한 GPCR 구조 내 신호전달체계의 map은 allosteric 및 orthosteric 신호전달경로에 대한 중요한 정보를 제공할 것이다. Part III. Structural studies of TRPV1 and the binding mode analysis of its modulators Transient receptor potential vanilloid subtype 1 (TPRV1)은 중추와 말초신경계에서 존재하는 비선택적 양이온 채널로서, 통증완화에 대한 중요한 치료 표적이다. TRPV1의 구조는 6개의 membrane-spanning domain(S1-S6)을 가지고, 이들 중 S1-S4는 voltage sensor 도메인, S5-S6는 pore 도메인을 이루는데, 이러한 단량체 4개가 모인 homotetramer 형태가 기능적 최소 단위를 이룬다. TRPV1은 통증에 대한 중요한 약물 타겟이지만 그 3차원 구조에 대한 X-ray 정보가 알려져 있지 않아, 그 기능이나 리간드들의 정확한 결합부위에 대해 아직 많이 알려져 있지 않고, 구조기반 약물설계에 어려움이 있다. 본 연구에서는 TRPV1의 tetrameric 상동수용체 모델을 바탕으로 신규물질인 diphenylamine계 화합물에 대한 결합모드 분석을 수행하였다. 분자도킹 및 분자동역학 시뮬레이션을 이용하여 리간드의 정확한 결합부위 및 결합모드를 예측하고자 하였고, 그 결과로 도출된 주요 아미노산 잔기들에 대하여 돌연변이 분석연구를 통해 평가하였다. 예측된 결합모드는 돌연변이 분석결과와 상당 부분 일치하였으며, 이는 이 상동수용체 모델과 리간드의 결합모델이 의미 있음을 뒷받침한다. 더 나아가, 단백질군 내에서의 서열보존도 및 정규모드분석, 네트워크 분석 등의 바이오인포마틱스 연구도 예측된 리간드 결합부위를 뒷받침하는 결과를 보여주었다. 본 연구를 통하여 TRPV1과 그 조절제 간의 상호작용을 분자적 수준에서 이해할 수 있었으며, 이는 새로운 TRPV1 리간드 설계에 기여할 것으로 생각된다.