포스파젠 고분자 약물 전달체의 분자 구조와 물성에 따른 암 조직 선택성에 관한 연구

Abstract

현재 임상에서 사용되고 있는 대부분의 항암제들은 암세포에 대한 선택성이 없어 심한 독성과 부작용을 동반한다. 이러한 문제점을 극복하기 위한 노력 중 하나가 지능형 고분자 약물 전달체를 이용한 고분자 요법이다. 이에 관한 연구는 꾸준히 지속되고 있지만 아직은 기초 이론인 EPR (enhanced permeability and retention) 효과에 대해서조차 기초연구 자료는 거의 찾아볼 수가 없다. 따라서 본 연구에서는 포스파젠계 고분자를 활용하여 암 조직 선택성을 결정하는 여러 가지 요인들 즉, 분자구조, 분자량, 나노 구조체의 입도, 입자 표면 물성 등에 관한 기초연구를 암을 유발시킨 동물모델에서 수행하였다. 이들의 생체 내 체류시간, 조직간 분포 및 암 조직 선택성 등을 측정, 비교함으로써 포스파젠계 고분자의 구조적 및 물성학적 요인들과 암 조직 선택성을 나타내는 EPR 효과와의 관계를 연구하였다. 또한 인간 위암 세포주 MKN-28과 인간 폐암 세포주 A549를 이식시킨 누드마우스로 합성된 포스파젠 고분자들의 조직 분포도 실험을 수행함으로써 각각의 암세포에서 포스파젠 고분자들의 암 조직 선택성 차이를 확인하였다. 본 연구에서는 폴리포스파젠 고분자의 친수성 그룹으로 분자량 550의 폴리에틸렌글리콜을 고정하고 소수성 그룹으로는 다양한 아미노산 또는 펩타이드를 선택하여 친수성 그룹과의 몰 비를 바꾸어 도입함으로서 총 7종의 새로운 포스파젠계 고분자를 설계, 합성하였다. 다시 이들 각 고분자들을 분자량이 50~100 kDa인 부분과 100 kDa 이상인 부분으로 분리하고, 폴리포스파젠 고분자의 조직 분포를 ex vivo 상에서 관측하기 위해 NIR (Near Infra-Red) 형광물질인 Cy5.5로 표지하여 총 14종의 고분자를 합성하였다. 대표적인 합성 폴리포스파젠 고분자 물질인 고분자 3-A와 고분자 7-A로 cell viability 실험을 수행한 결과, 실험한 전 농도에서 고분자 3-A 및 7-A의 cell viability가 80% 이상인 것으로 보아 합성한 폴리포스파젠 고분자의 세포 독성은 거의 없는 것으로 사료된다. Cy5.5가 표지된 폴리포스파젠 고분자를 인간 위암 세포주 MKN-28 또는 인간 폐암 세포주 A549가 이식된 누드마우스에 주사하여 주사 후 시간별 (14시간, 24시간, 48시간, 72시간)로 생체 내 주요 조직과 암 조직을 적출하고, Kodak Image Station 4000 MM을 이용하여 ex vivo imaging 실험을 수행하였다. 분자량이 50~100 kDa인 고분자와 분자량 100 kDa 이상인 고분자의 주사 후 시간에 따른 조직 분포의 변화를 살펴 보면, 둘 사이의 암 조직 선택성에는 큰 차이가 없었지만 분자량이 100 kDa 이상인 고분자의 경우 암 조직이나 신장보다는 간이나 폐 조직에 훨씬 많이 축적되었다. 친수성 그룹 PEG550과 소수성 그룹 Lysine ethyl ester를 3 : 1 몰 비로 갖는 고분자 3과 1 : 1 몰 비로 갖는 고분자 4의 조직 분포를 비교해 보았을 때, PEG550의 함량이 적은 고분자 4에서 전반적인 조직 분포 정도와 암 조직 선택성이 줄어 들었다. 또한, 소수성 그룹으로 LysEt 대신 dipeptide인 GlyLysEt를 도입한 고분자 1 및 2와 dilysine을 도입한 고분자 5 및 6의 ex vivo imaging 실험 결과도 유사하게 나타났으며, 특히 EPR 효과에 의한 암 조직 선택성에 있어서 고분자 3-A보다 우수한 것은 찾을 수가 없었다. 다른 고분자들보다 소수성이 높은 tripeptide인 GlyPheLysEt를 도입한 고분자 7로 실험한 결과, 타 조직에 비하여 암 조직에 많이 축적되었으며 72시간까지도 축적이 계속되었다. 또한, 고분자 3-A와 고분자 7-A의 시간에 따른 TTR (Tumor to Tissue ratio) 값을 비교해 보았을 때, 소수성이 강한 고분자 7-A가 고분자 3-A보다 암 조직 선택성이 훨씬 더 우수하였다. 고분자 3-A를 위암 세포주 MKN-28 대신 폐암 세포주 A549를 이용하여 같은 방법으로 ex vivo 실험을 수행한 결과 세포주 A-549에 대한 실험에서 다른 조직 대비 암 조직 분포가 훨씬 대조적으로 선명하게 나타났다. 결론적으로, 조직 분포 실험에서는 분자량 50~100 kDa인 고분자가 적합하며, EPR 효과에 의한 암 조직 선택성은 암 종에 따라 달라지므로 MKN-28보다는 A549가 더 적합하다. 또한 stealth 효과를 나타내 주는 PEG550의 함량이 감소하면 EPR 효과에 의한 암 조직 선택성에 필수 조건인 long circulation 성질이 감소되어, 결국 고분자의 암 조직 선택성이 줄어들게 된다. 소수성이 강하고 양이온성 고분자일 때 EPR 효과가 강해지는 것으로 사료되지만, 이는 향후 양친성 포스파젠 고분자의 양이온성과 소수성 중에서 EPR 효과에 보다 결정적인 영향을 주는 인자가 무엇인지 밝혀내는 것이 필요하다.;Most anticancer drugs currently being used in clinical trials exhibit severe toxicities due to their lack of tumor selectivity and a great deal of efforts to overcome such problems has been made in many different ways. One rational approach to improve tumor selectivity of drugs is to employ polymer drug conjugates as drug carriers. In particular, it is well known that amphiphilic polymers with an appropriate molecular size exhibit a high tumor selectivity driven by enhanced permeability and retention effect (EPR effect). The major factors responsible for EPR effect conferring polymer drug conjugates tumor selectivity are yet to be determined. Here, I assessed the relationship between EPR effect and molecular weight and amphiphilicity of polymers utilizing polyphosphazene-based drug delivery system by measuring their organ distribution in nude mice inoculated with human gastric cancer cells (MKN-28 cell) and the human lung cancer cells (A549 cell), respectively. Thus the main purpose of this study is to investigate the influence of chemical properties of polymers on their EPR effect and the difference in tumor selectivity of polymers depending on types of cancer. New amphiphilic polyphosphazene derivatives were synthesized by stepwise nucleophilic substitutions of hexachlorocyclotriphosphazene with equimolar a hydrophilic poly(ethylene glycol) with an average molecular weight of 550 (PEG550) and a hydrophobic amino acid or oligopeptide as side groups. When the synthetic reaction was completed, the resultant polyphosphazene polymer was fractionated using membrane dialysis into 3 groups of different molecular weights: polymer 1 of the molecular weight below 50,000, polymer 2 of the molecular weight in the range 50,000 to 100,000, and polymer 3 of the molecular weight above 100,000, respectively. The resulting polymers, then, were labeled with NIR fluorescence Cy5.5 for ex vivo image analysis. In vitro cell cytotoxicity of polymers was assessed by SRB staining assay and A549 cells treated with polymer 3-A and 7-A up to 10 mg/mL showed almost no in vitro cytotoxicity. In order to perform ex vivo image analysis, human gastric cancer cells (MKN-28 cell) and human lung cancer cells (A549 cell) were inoculated subcutaneously into the right flank of Balb/c nude mice. When the tumor volume reached above 300 mm3, the Cy5.5-labeled polyphosphazene with molecular weight between 50 kDa and 100 kDa and those above 100 kDa respectively, were injected in a tail vein and mice were sacrificed at 14h, 24h, 48h, and 72h after the drug administration. Subsequently, tumor, muscle, liver, lung, kidney and spleen were harvested from each mouse, and the fluorescence intensity of the labeled polymers in organs was analyzed using Kodak Image Station 4000 MM. No difference in tumor selectivity among polyphosphazene with different molecular weights was observed, but those with molecular weights above 100 kDa accumulated more in liver and lung tissues than in tumor tissues of mouse models of gastric cancer. In addition, biodistribution of polyphosphazene was assessed in terms of amphiphilicity, and polymers prepared by modifying them with hydrophilic PEG550 and hydrophobic lysine ethyl ester at molar ratio of 3 to 1 showed a better tumor selectivity compared to those modified with PEG550 and lysine ethyl ester at lower molar ratio of 1 to 1. When polyposphazene was modified with PEG550 and tripeptide GlyPheLysEt with the higher hydrophilic property, the resulting polymers, [NP(MPEG550)2.0(GlyPheLysEt)1.0]n, exhibited an improved tumor selectivity, having a larger tumor to normal tissue distribution ratio compared to those of other samples. Furthermore, polyphosphazene showed a better overall tumor selectivity in mouse models of lung cancer compared to those of gastric cancer, suggesting that specific cancer cell type may influence the extent of EPR effect of polymers. This study showed that polyphosphazene with molecular weight between 50 kDa and 100 kDa and those modified with PEG550 and tripeptide GlyPheLysEt exhibited better tumor selectivity over normal tissues. The improved tumor selectivity of polyphosphazene modified with a relatively large amount of PEG550 can be explained by stealth effect where PEG550 reduces the interaction of polymers with other biological molecules thereby lengthening in vivo circulation time of polymers and increasing their chances to be delivered to tumor. In addition, although hydrophobic and cationic polyphosphazene showed better tumor selectivity compared to those exhibiting amphiphilicity, further study is needed to investigate how such chemical properties enhance EPR effect of polymers.