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Role of the SNF2-family chromatin remodeling complexes in DNA repair and replication

Title
Role of the SNF2-family chromatin remodeling complexes in DNA repair and replication
Other Titles
DNA 복구와 복제에서 SNF2-family 크로마틴 리모델링 복합체의 역할
Authors
이한새
Issue Date
2012
Department/Major
대학원 생명·약학부생명과학전공
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Doctor
Advisors
권종범
Abstract
DNA in eukaryotic cell is compacted into nucleosomes and higher order chromatin structure, which creates a barrier to protein access to target DNA. Chromatin remodeling is the prominent mechanism that overcomes such barrier and is essential to all the nuclear processes using chromatin as substrate such as DNA repair and replication. Recent studies from our laboratory and others have shown that SWI/SNF and INO80, the two major ATP-dependent chromatin remodeling complexes, play important roles in DNA double strand break (DSB) repair and DNA replication under stressed conditions. SWI/SNF and INO80 are thought to contribute to genome stability and thereby tumor suppression through their activities to regulate DSB repair and DNA replication, respectively. However, the mechanisms by which these remodeling complexes exert their functions have remained largely unexplored. In this thesis, I investigated the molecular mechanisms that regulate the functions of SWI/SNF and INO80 in DSB repair and DNA replication, respectively. The aim of the first part of my thesis was to elucidate the mechanisms accounting for the previous finding of our laboratory that SWI/SNF facilitates DSB repair by stimulating the phosphorylation of histone H2AX at Ser-139 (S139ph) after DNA damage. I found that SWI/SNF binds to g-H2AX- (the phosphorylated form of H2AX) containing nucleosomes in S139ph-dependent manner. Unexpectedly, BRG1, the catalytic subunit of SWI/SNF, binds to g-H2AX nucleosomes by interacting with acetylated H3, not with S139ph itself, via its bromodomain. Blocking the BRG1 interaction with g-H2AX nucleosomes either by deletion or overexpression of the BRG1 bromodomain leads to defect of S139ph and DSB repair. H3 acetylation is required for the binding of BRG1 to g-H2AX nucleosomes. S139ph stimulates the H3 acetylation on g-H2AX nucleosomes, and the histone acetyltransferase Gcn5 is responsible for this novel crosstalk. The H3 acetylation on g-H2AX nucleosomes is induced by DNA damage. These results collectively suggest that SWI/SNF, g-H2AX and H3 acetylation cooperatively act in a feedback activation loop to facilitate DSB repair. In the second part of my thesis, I investigated the role of the INO80 complex in DNA replication and the underlying mechanisms. Although recent studies have implicated the INO80 complex in DNA replication under stressed conditions and the maintenance of genome stability, the role of INO80 in normal DNA synthesis remains unclear and the mechanisms that regulate the INO80 function in DNA replication are unknown. In this work, I showed that human Ino80 (hIno80), the catalytic ATPase subunit of the human INO80 complex, binds to the replication forks and facilitates fork elongation under normal, unperturbed conditions. I identified BRCA1-associated protein 1 (BAP1), the nuclear ubiquitin C-terminal hydroxylase that functions as tumor suppressor and has deubiquitinating activity for histone H2A, as a hIno80 interacting protein. BAP1 not only deubiquitinates and stabilizes hIno80 but also recruits hIno80 to the forks for efficient fork elongation during normal DNA synthesis. The BAP1-mediated hIno80 recruitment to the replication forks is based on the interaction between BAP1 and monoubiquitinated H2A that is localized at the forks. Notably, hIno80 is downregulated in the cancer cells lacking BAP1 expression and in the BAP1-defective tumors from malignant pleural mesothelioma patients, providing clinical relevance of my findings. Therefore, my work establishes a direct role for hIno80 in normal DNA synthesis and discovers a novel mechanism that targets this chromatin remodeler to the replication forks, and also sheds lights on understanding the mechanisms accounting for the tumor suppressor activity of BAP1.;진핵 세포의 DNA는 뉴클레오좀으로 압축되어 있으며 DNA를 목표로 하는 단백질의 접근을 막는 장벽이 된다. 크로마틴 리모델링은 이러한 장벽을 극복하는 대표적인 기작으로 DNA 복구나 복제 같은 핵 과정에서 필수적이다. 본 연구진과 세계의 최근 연구에 따르면 SWI/SNF와 INO80 라는 두개의 주요 ATP 의존적인 크로마틴 리모델링 인자는 DSB 복구와 스트레스 하의 DNA 복제에 중요한 역할을 하는 것으로 나타나고 있다. SWI/SNF와 INO80는 유전체 안정성에 기능하며, DSB 복구와 DNA 복제를 조절하며 암 억제인자로서 기능할 것으로 보여진다. 하지만 이러한 기능을 어떻게 수행하는지에 대해서는 그 기작이 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 DSB 복구와 DNA 복제에서 SWI/SNF와 INO80의 기능 조절의 기작을 밝혔다. 첫번째로 DSB 손상 후에 SWI/SNF가 H2AX의 S139 인산화를 활성화 시키면서 DSB 복구를 가속화 시킨다는 이전의 연구결과에 대해 그 기작을 밝혀냈다. 먼저 SWI/SNF가 S139 의존적으로 gamma-H2AX (H2AX의 인산화 형태) 와 결합하고 있음을 보였다. 놀랍게도, SWI/SNF의 중심단백질인 BRG1은 자신의 브로모도메인을 통해 H2AX의 S139가 아니라 아세틸화 된 H3와 결합함으로서 gamma-H2AX가 포함된 뉴클레오좀과 상호작용 하고 있었다. 과발현된 BRG1이나 브로모도메인이 제거 된 BRG1으로 BRG1과 gamma-H2AX의 결합이 방해되면 S139의 인산화와 DSB 복구가 저해되었다. 또한 H3의 아세틸화는 BRG1이 gamma-H2AX에 결합하는데 필수적임을 규명하였다. 이러한 결과는 SWI/SNF와 gamma-H2AX, 그리고 H3의 아세틸화가 DSB 복구를 가속화하는 피드백 고리를 형성하고 있음을 보여주고 있다. 두번째로는 INO80가 DNA 복제에 기능하는 기작을 밝혔다. 최근의 연구에서 INO80가 스트레스 하의 DNA 복제에 관련되어 있으며 유전체 안정성을 유지한다는 것은 알려져 있으나, 정상 상태에서 DNA 복제에 INO80가 어떻게 기능하는지에 대해서는 그 기작을 알지 못했다. 본 연구에서는 인간의 INO80의 중심 단백질인 hIno80가 정상상태에서 DNA 복제의 fork에 결합하여 복제를 돕는다는 사실을 밝혔다. 또한 Bap1 이라는 탈유비퀴틴 효소가 암 억제인자로 작용하면서 H2A를 탈유비퀴틴 시키고 hIno80와 결합한다는 것을 규명하였다. Bap1은 hIno80를 탈유비퀴틴화 시킬 뿐 아니라 안정화 시키면서 DNA 복제 fork쪽으로 hIno80를 결집시키고, 이는 효과적인 DNA 복제를 돕는다. Bap1에 의한 hIno80의 DNA 복제 fork로의 결집은 Bap1과 DNA 복제 부분에 위치한 uH2A와의 결합을 기저로 이루어진다. MPM 암 환자의 Bap1 결손 세포에서 hIno80 또한 결손 되어 있음을 관찰하였고, 이것은 본 연구의 임상에서의 타당성을 보여준다. 그러므로 본 연구는 정상상태의 DNA 합성에서 hIno80의 직접적인 역할을 밝힘과 동시에 크로마틴 리모델링 인자가 DNA 복제에 어떻게 결집되는지를 밝혀 암 억제 인자로서의 Bap1을 설명하는 기작을 제시하였다.
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일반대학원 > 생명·약학부 > Theses_Ph.D
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