Regulation mechanism of Nox1 by phosphorylation and ubiquitination

Abstract

Although reactive oxygen species (ROS) are classically describe as harmful by-products in aerobic metabolism, many reports have demonstrated that ROS play crucial roles in a variety of biological processes. In the part I, it is shown that Ser282 residue of Nox activator 1 (NoxA1) is phosphorylated by Erk in response to EGF resulting in desensitization of Nox1 activity. Specifically, NoxA1 protein is detected as two independent protein bands in SDS-PAGE, and the form of protein with higher mobility shifted to and merged with the one with lower mobility in response to EGF treatment. Hypothesizing that NoxA1 phosphorylation was the cause for the change in mobility, we tested the effect of various protein kinase inhibitors to identify the protein kinase involved in phosphorylation of NoxA1. Pretreatment with PD98059 resulted in inhibition of NoxA1 migration in response to EGF indicating that Erk is involved in the process. NoxA1 protein contains two potential Erk phosphorylation targets, Ser239 and Ser282. Site-directed mutagenesis showed that S282A mutant but not S239A mutant failed to respond to EGF, demonstrating that Ser282 is the target amino acid of Erk. To explore the role of Ser282 phosphorylation in EGF-induced ROS generation, superoxide anion production in response to EGF was measured in HEK293-Nox1 cells. Expression of S282A mutant of NoxA1 in these cells led to increased superoxide anion production in response to EGF compared to expression of the wild type, whereas the expression of S282E, a phosphomimetic mutant, resulted in significantly decreased superoxide anion generation. Also, the phosphorylation of Ser282 of NoxA1 affects Rac activation. Expression of S282A mutant of NoxA1 up-regulated the Rac activity, whereas expression of S282E mutant led to abrogation of Rac activation. These results demonstrate that phosphorylation of NoxA1 is a part of the feedback mechanism that functions through activation of Rac with a net outcome of negative modulation of Nox1 activity. In the part II, it is shown that the Nox organizer 1 (NoxO1) protein regulates Nox1 complex through protein modification. To identify the binding protein for NoxO1, yeast-two hybrid analysis was performed and Grb2 was obtained as a candidate of a novel NoxO1-interacting protein. Subsequently, GST pulldown assay and co-immunoprecipitation revealed that Grb2 can interact with proline-rich region (PRR) of NoxO1 through its SH3 domain. In addition, overexpression of Grb2 resulted in decreased Nox1 activity. Grb2 is a well-known adaptor protein that interacts with Sos for activation of Ras as well as binds to Cbl protein for endocytosis and ubiquitination. Interestingly, unlike Nox1 and NoxA1, only NoxO1 protein was degraded by overexpression of Cbl protein, which completely inhibited by treatment of MG132 suggesting that NoxO1 protein is ubiquitinated in Cbl-dependent manner. To validate the effect of NoxO1 on Nox1 activity, EGF-induced ROS generation and NoxO1 stability were observed in HCT116 cells. Interestingly, NoxO1 expression was increased in response to EGF stimulation. Moreover, the destability of NoxO1 was consistent with EGF-induced ROS generation and NoxO1 expression was enhanced by pretreatment of MG132. Taken together, NoxO1 expression is definitely regulated by Cbl-mediated ubiquitnation-dependent proteasomal proteolytic pathway, which in turn affects EGF-induced ROS generation through Nox1 complex. Taken together, it is demonstrated that Nox1 activity is regulated by post-translational modifications including phosphorylation and ubiquitination.;활성산소는 본래 세포내 호흡 또는 에너지 대사의 부산물로서 세포에 독성을 나타내는 물질로 인식되었으나 최근 많은 연구결과를 통해 다양한 외부자극에 의해 정교하게 조절되며 세포내 신호전달체계에 있어 이차 신호전달물질로 작용한다는 것이 잘 알려져 있다. 세포내 신호전달체계에서 이차 신호전달물질로 작용하는 활성산소는 NADPH oxidase (Nox)라는 효소를 통해 생성된다. Nox family에 속하는 7개의 단백질 중 Nox2/gp91phox가 가장 먼저 발견, 연구되어 있는데 이 단백질은 과립백혈구, 단핵백혈구, 대식세포와 같이 선천성 면역반응을 일으키는 데 관여하는 포식세포에 많이 발현되어 있으며 외부에서 침입한 세균을 죽이는 과정에 필요한 활성산소를 생성하는 데 중요한 역할을 한다. Nox2/gp91phox의 활성은, 세포막 단백질인 p22phox, 세포질 단백질인 p47phox, p67phox 그리고 small GTPase Rac으로 구성된 단백질 복합체에 의해 조절된다. Nox2/gp91phox는 p22phox와 함께 세포막에 존재하고 있는데 세균의 침입이나 외부 자극에 의해 p47phox가 인산화 되면서 구조의 변화가 일어나 p22phox와 결합한 후 세포질 단백질인 p67phox와 p40phox의 결합을 유도하여 하나의 복합체를 이루게 된다. p47phox는, PX domain과 2개의 SH3 domain과 한 개의 PRR domain, 그리고 이들 사이에 autoinhibitory region (AIR)을 가지고 있는데 평상시에는 AIR, SH3 domain, PX domain이 결합되어 있는 상태로 있어 다른 단백질과의 결합이 이루어지지 못하게 되어있다. 그러나 외부자극에 의해 활성화된 PKC 등에 의해 AIR 및 그 주변에 인산화가 일어나면 단백질에서의 구조적인 변화가 일어나 각 domain이 노출되어 SH3 domain은 p22phox의 PRR domain과, PRR domain은 p67phox의 SH3 domain과의 결합을 통해 단백질 복합체를 형성한다. 여기에 p67phox의 아미노 말단 부위에 활성화된 Rac이 결합함으로써 Nox2를 통한 활성산소가 생성이 가능해진다. Nox2/gp91phox가 발견된 이래 비포식세포에서도 Nox2/gp91phox과 유사한 단백질들이 존재한다는 것이 보고되었다. 이 단백질들은 구조상의 높은 유사성에도 불구하고 발현되는 조직이나 효소 활성에 요구되는 보조인자들의 종류, 생성되는 활성산소의 종류나 양에서 확연히 구별되는 차이를 보인다 (Figure 2A). 이는 다양한 외부침입인자에 대한 적절한 신호전달체계를 활성화시키기 위한 것과 무관하지 않아 보인다. 본 연구에서는, Nox family 중에서 Nox1의 활성조절에 초점을 맞춰 진행하였다. Nox1은, 가장 먼저 밝혀진 Nox2/gp91phox의 유사체로서 Lambeth group에 의해 보고된 이래 세포 내 기능이 밝혀지기 시작하였다. Nox1은 Nox2/gp91phox와 유사한 구조로 되어있지만 p47phox의 유사체인 NoxO1와 p67phox의 유사체인 NoxA1에 의해 활성이 조절된다는 점에서 차이를 보인다. 그러나 세포막 단백질인 p22phox, 세포질 단백질인 NoxO1와 NoxA1, 그리고 small GTPase Rac으로 이루어진 복합체에 의해 Nox1이 활성화되고 복합체 형성과정에 SH3 domain과 PRR domain 사이의 결합이 중요하며 여기에 p67phox의 유사체인 NoxA1의 아미노 말단 부위에 활성화된 Rac이 결합한다는 점에서 여전히 Nox2/gp91phox와의 유사성을 간직하고 있다. 최근 몇 년 동안 Nox1의 활성조절을 위한 기전에 대한 연구결과들이 보고되고 있는데 한 보고에 의하면 PKA에 의해 NoxA1의 Ser172와 Ser461 잔기가 인산화되어 14-3-3ζ단백질과 결합하게 되면 복합체로부터 해리됨으로써 Nox1의 활성을 감소시킨다. 또한 c-Src에 의해 NoxA1의 Tyr110 잔기와 Tks4의 Tyr508 잔기가 인산화되면 NoxA1과 Tks4 사이에 결합이 일어나 Nox1을 통한 활성산소 생성을 유도한다는 보고를 통해 NoxA1의 인산화를 통해 Nox1의 활성이 조절되고 있음을 확인할 수 있다. 이와 같은 맥락으로, 본 연구의 첫 번째 파트에서는 Erk에 의해 NoxA1의 Ser282 잔기가 인산화되면 Rac의 활성이 감소되어서 Nox1의 활성을 감소시킨다는 것을 보여주고 있다. 이렇듯 NoxA1의 인산화를 통해 Nox1의 활성을 조절할 수 있다는 연구는 활발히 진행되고 있지만 NoxO1이 어떻게 조절되고 그 결과로서 Nox1 활성이 조절되는지에 대한 보고는 전무하다. NoxO1은 p47phox과 구조적으로 유사하지만 AIR이 없기 때문에 외부자극에 관계없이 p22phox-NoxO1-NoxA1 복합체가 형성되어 Nox1의 활성을 나타내는 데 기여한다. 이는 Nox1의 활성이 외부자극과 무관하게 지속적으로 유지가 된다는 것을 의미한다. 그러나 이러한 추론은, 이전 보고에서와 같이 EGF, PDGF, PMA 등의 자극을 주고 Nox1을 통해 생성되는 활성산소를 측정했을 때 매우 짧은 시간 (~5분) 안에 많은 양의 활성산소가 생성되었다가 빠르게 원상복귀 되는 경향을 설명할 수 없을 뿐만 아니라 Nox의 활성이 정교하게 조절된다는 가설에 위배된다. 이에 본 연구의 두 번째 파트에서는 NoxO1 ubiquitination을 통해 Nox1의 활성조절이 이루어진다는 것을 보여주고 있다. 이러한 결과들을 바탕으로 다음과 같은 Nox1 활성조절 기전 모델을 세울 수 있다. 자극이 없을 때 NoxO1은 Grb2를 통해 Cbl과 결합되어 있는 상태로 존재하면서 지속적으로 ubiquitination이 일어나 NoxO1의 분해 및 그에 따른 Nox1 복합체의 붕괴를 유도하여 비활성화된 상태를 유지하다가 EGF와 같은 자극에 의해 Grb-Cbl과의 결합이 붕괴되면서 NoxO1 ubiquitination이 일어나지 않게 되고 NoxA1과의 결합이 가능해짐으로써 Nox1을 활성화시키는 데 기여한다. 더욱 주목할 것은, 자극에 의해 활성화된 이후 다시 원래의 상태로 돌아오게 되는 과정에서 NoxA1의 인산화가 중요하다는 것이다. 즉, Erk에 의해 NoxA1 인산화가 일어나게 되면 NoxO1의 발현이 여전히 높은 상태를 유지하고 있더라도 (Figure 15C) Rac의 활성이 감소됨으로써 Nox1의 활성이 떨어지게 된다. 따라서 본 연구는, 활성산소의 생성이 매우 정교하게 조절되고 있음을 실험적으로 증명하고 이를 설명하기 위한 모델을 구축하였다는 점에 큰 의의가 있다고 할 수 있다.