Development of Topoisomerase IIα Catalytic Inhibitors and Analysis of Their Anticancer Activity in Colon Cancer Cells

Abstract

Topoisomerases (topos) are enzymes that regulate the DNA replication, chromosome condensation and segregation. Topos solve the topological problem by introducing temporary single- or double-strand breaks in the DNA. Topos can be classified into two major classes: topoisomerase I (topo I) that induce single strand cut in DNA, and topoisomerase II (topo II) that cut and pass double strand DNA. Topos are one of the major target for anti-cancer drugs because they are overexpressed in various cancer cells, and play an essential role in replication, transcription and chromosome segregation. Topo II inhibitors are classified as topo II poisons and catalytic inhibitors. Topo II poisons stabilize the cleavage complex and induce DNA breaks. Although topo II poisons have been used for clinical treatment of cancers, they have many side effects. On the other hand, catalytic inhibitors act on the other steps in the catalytic cycle without trapping the cleavage complex. Therefore catalytic inhibitors of topo II can be a good anti-cancer drug due to low side effects and DNA toxicity. In this study, biological and topo inhibitory activity of compounds were evaluated. From the topoisomerase relaxation assay and cell viability assay of twenty one compounds, comp 5, MR-3D and MR-3L were chosen as the candidate compounds for further research. Based on the results obtained from various assays including decatenation, relaxation, unwinding, ATPase and stabilization of cleavage complex assays, it can be concluded that comp 5 inhibits ATP hydrolysis leading to inhibition of topo II and the MR-3D and MR-3L act as DNA intercalating topo II catalytic inhibitors. Additionally, the molecular docking study and ATP-compound competition assay revealed that comp 5 has a stable binding pattern to the ATP-binding domain of human topo II, which correlated with the above experimental results. Comp 5 and MR-3D, which was more effective than MR-3L, were further examined for its mechanism of action in HCT15 colon cancer cells. From the increase in protein levels of cleaved caspase-3 and cleaved PARP, it was confirmed that comp 5 and MR-3D inhibited proliferation and induced apoptosis. Cell cycle analysis of MR-3D treated cells showed that it induced G1 arrest. Comp 5 inhibited multidrug resistance (MDR) through down regulation of MDR1 protein expression in Adriamycin-resistant breast cancer cells. Taken together, comp 5, defined as a topo II catalytic inhibitor, can be utilized to overcome the drug resistance by co-treating with other drugs which have MDR. Also, MR-3D can be expected to serve as a lead compound in the development of topo II catalytic inhibitor.;Topoisomerase (topo)는 DNA 위상에 관여하는 효소로 DNA 복제, 전사, 세포분열 등의 과정에서 생기는 DNA문제를 해결한다. Topo는 DNA를 자르고 꼬인 것을 푼 뒤 다시 붙여주는 역할을 하며 단일 가닥을 자르는 topoisomerase I (topo I)과 이중 가닥을 자르는 topoisomerase II (topo II)로 나뉜다. Topo는 그의 역할과 암세포에 과발현되어 있는 특징 때문에 이전부터 항암제 개발의 타깃으로 이용되었다. 대표적인 topo I 억제제로 camptothecin, topo II 억제제로 etoposide가 있다. Topo II 억제제는 작용기전에 따라 독성 억제제와 촉매 억제제로 구분된다. 독성 억제제는 topo와 DNA 절단복합체를 안정화시켜 topo의 활성을 억제시키며 DNA 손상을 일으키는 것이 특징이다. 촉매 억제제는 그 외의 단계에서 작용하는 억제제로 독성 억제제보다 독성이 적어서 부작용이 적은 항암제로의 개발 가능성이 크다. 본 연구에서는 topo II 촉매 억제제 개발을 목표로 화합물이 topo II에 어떠한 기전으로 작용하는지 알아보고 세포상에서 어떠한 효과를 보이는지 확인하였다. 영남대학교 장영동 교수님께 tryptanthrin의 유도체 8개와 King Saud University Rhaman교수님께 합성 화합물 13개를 제공받아 화합물들의 topo I과 IIα의 활성 억제 효과와 4 가지 인간 암 세포주에서 세포독성을 보고 tryptanthrin의 유도체 중 comp 5, Rhaman 교수님 합성화합물 중 MR-3D, MR-3L을 선도물질로 정하였다. Comp 5, MR-3D 그리고 MR-3L이 topo에 어떠한 기전으로 작용하는지 확인하기 위해 relaxation assay, cleavage complex assay, unwinding assay, ATPase assay를 수행하였다. 위의 실험들을 통해 comp 5가 ATP hydrolysis 활성을 억제한다는 것을 확인하였다. 추가적으로 molecular docking study, ATP-compound competition assay를 하여 comp 5가 topo IIα ATP 결합부위에 작용하고 ATP와 경쟁적으로 작용한다는 것을 확인하였다. MR-3D와 MR-3L은 DNA에 결합하는 끼어들기 약물로 작용하여 촉매 억제제로서 topo IIα 활성을 억제한다는 것을 확인하였다. 세포상에서의 실험은 comp 5와 MR-3L보다 좋은 효과를 보인 MR-3D만 진행하였다. HEK293 세포에서 migration assay를 시행하여 MR-3D와 comp 5의 증식 억제 효과 확인하였다. 또한 western blot을 통해 분절된 caspase-3와 분절된 PARP 단백질이 증가함을 관찰하여 comp 5와 MR-3D가 세포사멸을 유도하는 것을 확인하였다. 추가적으로, MR-3D는 화합물 처리 후 세포주기를 분석하여 MR-3D가 G1 arrest를 일으키는 것을 확인하였고, G1 arrest와 관련된 cyclin D, p27kip1의 단백질의 증감을 확인함으로써 G1 arrest를 유발하는 것을 다시 확인하였다. Comp 5는 Adriamycin에 내성을 갖는 MCF7adr 세포주에 Adriamycin과 comp 5를 병용처리하여 약하지만 내성을 극복하는 것을 보았고 western blot 실험을 통하여 MDR1 단백질의 발현 감소에 기인한 것이라는 것을 확인하였다. 결론적으로 comp 5는 DNA 손상을 크게 일으키지 않는 topo 촉매 억제제로서 MDR1을 통한 약물 내성이 있는 다른 화합물의 내성 극복을 위하여 병용 처리 가능을 제시하였고, MR-3D는 끼어들기 약물로 작용하는 topo II의 촉매 억제제 개발 가능성을 보았다.