Pharmacokinetic Study of NOX Inhibitor in Two Different Formulations

Abstract

A hydrochloride salt form of #18-211 (3-phenyl-4-propyl-1-(pyridine-2-yl)-1H-pyrazol-5-ol), #18-278 is a novel NOX inhibitor designed to selectively inhibit NOX1 and NOX4 for the treatment of osteoporosis. A simple and reliable fully validated HPLC-UV method for the determination of #18-278 in rat plasma was successfully applied to evaluate the pharmacokinetics (PK) of #18-278 following intravenous and oral administration to rats. The analytical method showed excellent specificity, linearity, precision, accuracy, sensitivity, extraction recovery and stability. After addition of the internal standard (IS) #18-212 (4-benzyl-3-phenyl-1-(pyridine-2-yl)-1H-pyrazol-5-ol), plasma samples were precipitated with acetonitrile and separated on a Shiseido-Capcell-pak C18 MG120 column (3.0 mm x 250 mm, 5 µm) with an isocratic mobile phase consisting of acetonitrile (0.1% TFA)-water(0.1% TFA) (65:35, v/v) at a flow rate of 0.5 mL/min. Good linearity was achieved over the concentration range from 0.05 to 10 μg/mL (r = 1.000). Intra- and inter-day precision ranged from 2.7% to 16.4%, and intra- and inter-day accuracy values were from 91.5% to 104.2%. #18-278 was stable after short-term (room temperature, 37˚C) and long-term (2 weeks, 4 weeks at both -20˚C and -70˚C) storage and after going through three times of freeze and thaw cycles. Post-preparative stability and stock solution stability were also found to be stable. When #18-278 was formulated with a various and excessive amount of surfactants and DMSO (Dimethyl sulfoxide) (named DMSO formulation), #18-278 was immediately absorbed and widely distributed to body organs with the elimination half-lives of approximately 4 h and 13 h after IV and oral administration, respectively. The pharmacokinetic profile of #18-278 was very similar to its corresponding free form, #18-211 (DMSO formulation). In order to observe the true pharmacokinetics of #18-278, a substitutable formulation based on diazepam injection formulation (named Diazepam Injection-based formulation) was designed. This formulation fully solubilized #18-278 by using co-solvents and thoroughly excluded the inappropriate use of surfactants and DMSO. When #18-278 was dissolved in the Diazepam Injection-based formulation, absorption and the oral bioavailability decreased compared to DMSO formulation. On the contrary, a longer half-life and a higher bioavailability were rather achieved when the same dose of #18-278 was orally administrated with twice the amount of co-solvents. This present study is significant in that the HPLC-UV analytical method and an acceptable formulation were well applied to access the pharmacokinetics of a NOX inhibitor #18-278.;#18-278은 #18-211의 salt form으로 NOX1 및 NOX4의 선택적 억제를 통해 골다공증 치료를 목적으로 합성된 NOX 억제제이다. 본 연구의 목적은 쥐 혈장에서 #18-278을 정량하기 위한 최적의 HPLC 분석법을 확립하고, 쥐에 정맥 주사 또는 경구 투여 후 얻은 혈장 샘플을 분석하여 약물동태학적 파라미터를 도출 및 평가하는 것이었다. 이 분석법은 FDA에서 제시하는 생체시료 분석법 밸리데이션 가이드라인을 따랐으며, 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성 및 감도 측면에서 기준에 적합함이 검증되었다. 이와 같이 검증된 방법은 동물실험 후 얻은 혈장 샘플을 분석하여 #18-278의 농도를 검출하는데 적용되었다. 혈장 샘플에 내부표준물질인 #18-212를 가한 후 #18-278을 정량하기 위하여 아세토니트릴로 추출하였다. 혈장 중 약물농도 분석을 위해 Shiseido Capcell-pak C18 MG120 컬럼 (3.0 mm x 250 mm, 5 µm)을 사용하였으며, 0.5 mL/min의 유속으로 이동상인 아세토니트릴 (0.1% TFA)-물 (0.1% TFA) (65:35, v/v)을 HPLC로 흘려주었다. 표준 검량선은 0.05-10 μg/mL의 농도범위에서 직선성을 나타내었다 (r = 1.000). 혈장 중 #18-278은 실온과 37˚C에서 6시간 동안 안정했고, 전처리 후 안정성을 비롯하여 세 차례에 걸친 냉∙해동 및 4주간의 장기보관 후에도 모두 안정함을 확인하였다. #18-278을 과량의 계면활성제 및 디메틸설폭시화물로 제형화하였을 때 #18-278은 신속히 흡수되고 체내에 널리 분포하였으며 반감기는 정맥 투여의 경우는 약 4 시간, 경구 투여의 경우에는 약 13 시간이었다. 또한, 경구 생체이용률은 48.8%이었다. 이러한 약물동태학적 양상은 #18-278의 salt form이며 본 실험실에서 이전에 연구되었던 #18-211과 매우 유사하였다. 또한, 본 연구에서는 과량의 계면활성제 및 사람에게 사용을 전면 금지한 디메틸설폭시화물을 이용한 제형이 인체에 투여하기 부적절하므로, 인체에투여 가능한 제형을 모색한 후 이 제형에서의 #18-278의 약동학을 평가하고자 하였다. 새 제형은 디아제팜 주사제 제형을 토대로 한 공용매 기법으로 용해도가 낮은 #18-278을 투여하기 적절한 제형으로 변형하여 사용하였다. 새 제형으로 투여하였을 때 통계적 유의성은 없었지만 기존의 제형에 비하여 AUC, 반감기 및 경구 생체이용률이 다소 감소하였다. 하지만 같은 약물 용량을 두 배의 공용매에 녹여 저농도로 투여한 경우에는 오히려 반감기 및 경구 생체이용률이 향상되었다. 따라서, 본 연구는 #18-278의 최적의 HPLC-UV 분석법을 확립 및 검증하였고, 사람에게도 투여 적절한 제형 모색을 통해 NOX 저해제인 #18-278의 보다 정확한 약물동태학적 결과를 도출했다는 점에서 의의가 있다.