Characterization of single-chain variable fragment (scFv) directed against receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) which inhibits osteoclast differentiation

Abstract

우리 몸의 뼈는 많은 구조와 기능을 유지하기 위하여 계속적으로 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대치하는 과정을 진행하게 되는데 이를 골재형성(bone remodeling)이라고 부른다. 골재형성의 과정은 칼슘의 균형을 유지하거나 충격으로부터 손상을 입은 뼈를 회복시키거나 할 때 중요하다. 뼈는 파골 세포 (osteoclast)로 인해 흡수되며 조골세포 (osteoblast)로 인해 형성되는데 이 두 세포의 균형이 무너지게 되면 골다공증 (osteoporosis)과 같은 질병이 생기게 된다. 파골 세포의 분화과정에는 전구 조골세포의 역할이 필수적인데 전구 조골세포의 표면에 있는 RANKL (Receptor activator of NF-kB Ligand)가 파골 세포의 전구세포 표면에 있는 RANK와 결합을 하면 파골 세포로 분화된다. RANKL와 RANK의 결합으로 인해 NF-kB, MAPK 신호전달 체계를 활성화시키고 c-Fos, NFATc1과 같은 전사인자를 활성화시키는데 이것이 파골 세포의 분화를 촉진시킨다. 이러한 파골 세포가 분화되는 일련의 과정을 억제함으로써 골다공증과 같은 질병을 치료 또는 예방하기 위하여 RANKL에 대한 항체를 제작하여서 그 효과를 보았다. RANKL에 대한 항체는 항체가 항원을 인식하기 위해 필요한 최소단위인 VH와 VL로부터 구성된 single-chain variable fragment를 제작을 하였다. 9가지 Ab 중에서 2가지 Ab가 파골 세포 분화를 억제할 수 있는 효과를 가진다는 것을 알 수가 있었다. 가장 효과가 좋았던 3F1 RANKL Ab를 이용해서 mouse RANKL의 자극으로 인해 IkBa와 JNK, p38의 인산화가 증가하는 것이 억제되었음을 볼 수 있었다. 그리고 이 3F1 RANKL Ab가 mouse RANKL에 의한 NFATc1의 발현 또한 억제시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다. 성숙한 파골 세포에서 발견할 수 있는 actin ring의 형성도 3F1 RANKL Ab로 인해 형성이 안 되는 것도 관찰할 수 있었다. 이러한 결과들은 3F1 RANKL Ab가 RANKL에 의한 NF-kB와 MAPK의 활성화를 저해함으로써 파골 세포 분화를 억제한다는 것을 시사한다.;Osteoclasts, specialized bone-resorbing cells derived from multipotent myeloid progenitor cells, play a crucial homeostatic role in skeletal remodeling and bone destruction in many pathologic conditions. Receptor activator of NF-kB ligand (RANKL) is an essential molecule for osteoclast differentiation. Here we studied inhibitory roles of single-chain variable fragment (scFv) directed against RANKL in RANKL-induced osteoclastogenesis of bone marrow-derived macrophages (BMMs). The phage display screening of scFv library with mouse RANKL gave us 8 clones, of which 3F1 and 4D3 significantly inhibited osteoclast differentiation of BMMs stimulated with both mouse and human RANKL in dose dependent manner. When BMMs were differentiated to osteoclast by RANKL, 3F1 decreased phosphorylation and degradation of IκBα, activation of mitogen-activated protein kinases and induction of c-Fos as well as consequent induction of nuclear factor of activated T cell, cytoplasmic 1 that is a pivotal determinant of osteoclastogenesis. In addition 3F1 suppressed formation of actin ring that is a characteristic feature of mature osteoclasts, and bone resorption. These results might be applicable to the development of a fully human monoclonal antibody against RANKL for treatment of bone diseases.