Endoplasmic Reticulum Stress as a Novel Target to Ameliorate Epithelial-to-Mesenchymal Transition and Apoptosis in Human Peritoneal Mesothelial Cells

Abstract

Long-term peritoneal dialysis (PD) results in functional and structural alterations in the peritoneal membrane. Epithelial-to-Mesenchymal Transition (EMT) and apoptosis of peritoneal mesothelial cells are known to be the earliest mechanisms of peritoneal fibrosis. Endoplasmic reticulum (ER) stress with an unfolded protein response is regarded to play a role in the development of apoptosis and EMT. To investigate the potential role of ER stress as a target to prevent and/or delay the development of peritoneal fibrosis, the effect of modulation of ER stress on EMT or apoptosis of human peritoneal mesothelial cells (HPMCs) was examined with an elucidation of mechanisms of protective effect of ER stress preconditioning on TGF-β1-induced EMT. EMT was evaluated by morphological changes of HPMCs and the expressions of E-cadherin and α-smooth muscle actin (α-SMA) with ER stress inducers, tunicamycin (TM) or thapsigargin (TG). TM and TG induced EMT from the concentrations of 0.01 ng/ml and 0.01 nM, respectively with an enhanced phosphorylation of Smad2/3, an increased nuclear translocation of β-catenin and Snail expression. TM or TG at the concentrations inducing EMT in HPMCs did not induce apoptosis up to 48 hours, however high concentration of TM (>1 ng/ml) or TG (>1 nM) induced apoptosis at 12 hours with a persistent increase in the expression of C/EBP homologous protein (CHOP). TGF-β1 induced ER stress in HPMCs, which was expressed as an increase in the expression of GRP78/94 and ATF6 with XBP-1 splicing. TGF-β1 induced EMT of HPMCs at 24 and 48 hours, which was confirmed by a transition of cell morphology and altered expression of epithelial and mesenchymal cell markers. TGF-β1 also induced apoptosis of HPMCs. TUDCA, an endogenous bile acid known to attenuate ER stress, blocked TGF-β1-induced EMT and apoptosis in HPMCs. Pre-treatment with TM or TG for 4 hours protected the cells from TGF-β1-induced EMT and apoptosis in HPMCs, demonstrating the role of ER stress as an adaptive response that served to protect HPMCs from phenotype transition and apoptosis. Peritoneal mesothelial cells isolated from PD patients expressed an increase in GRP78/94 which was correlated with the degree of EMT. These findings suggest the modulation of ER stress in HPMCs could serve as a novel approach to ameliorate EMT and apoptosis in the pathogenesis of peritoneal fibrosis.;복막의 섬유화는 장기간 복막투석을 받는 환자에게 발생되는 합병증이다. 특히, 상피-중간엽 세포이행(Epithelial-to-Mesenchymal Transition, EMT)과 세포사멸(Apoptosis)은 복막손상의 발생이나 진행에 중요한 기전이다. 소포체 스트레스(Endoplasmic Reticulum Stress, ER stress)는 세포 항상성을 유지하기 위한 세포의 중요한 보상기전이지만, 강도가 과도거나 장기간 유지되는 소포체 스트레스는 세포사멸을 유도한다. 소포체 스트레스가 복막 중피세포의 EMT및 세포사멸에 미치는 영향에 관해서는 아직 연구된 바 없다. 본 연구에서는 복막 중피세포에서 소포체 스트레스의 조절이 EMT와 세포사멸에 미치는 영향과 관련 기전에 관해 연구하였다. 소포체 스트레스 유도제인 Tunicamycin (TM, 0.01ng/ml)과 Thapsigargin (TG, 0.01nM)을 처리하였을 때 복막 중피세포의 EMT (12시간)가 유도되었다. 또한, EMT에 중요한 메커니즘인 Smad2/3의 인산화, β-catenin의 핵 내 이동, Snail의 발현을 증가시켰다. TM과TG는 EMT를 유도하지만, 세포 사멸을 유도하지 않았다. 하지만, 고농도 TM (>1ng/ml)과TG (>1nM)를 처리하였을 때 복막 중피세포의 사멸을 유도하였고, C/EBP homologous protein (CHOP)의 발현을 증가 시켰다. 소포체 스트레스 차단제인 Tauroursodeoxycholic acid (TUDCA)는 TM과 TG에 의해 발생되는 EMT와 세포사멸을 차단하였다. TGF-β1에 의한 복막 중피세포의 EMT및 세포사멸은 TUDCA 및 TM과 TG의 전처치 (4시간)로 의미있게 완화되었다. 복막투석 환자에서 분리된 중피세포에서 GRP78/94 발현은 의미있게 증가되었으며E-cadehrin 및 α-SMA발현과 의미있는 상관을 보였다. 본 연구는 복막 중피세포에서 소포체 스트레스를 차단하거나 전처치 함으로써 중피세포의 EMT 및 세포사멸을 억제할 수 있다는 결과를 최초로 보고한 것으로 향후 복막섬유화 치료의 새로운 표적으로서의 가능성을 제시 하였다.