The effect of gabapentin on the activity of the rat glutamate transporter type 3 expressed in Xenopus oocytes

Abstract

Gabapentin is a derivative of the inhibitory neurotransmitter γ-aminobutyric acid (GABA) with recognized efficacy in the treatment of both epilepsy and neuropathic pain. The pharmacological mechanism by which this agent exerts its clinical effects has, until recently, remained unclear. We investigated the effect of gabapentin on the activity of excitatory amino acid transporter type 3 (EAAT3), a protein that can regulate extracellular glutamate concentrations in the brain. EAAT3 was expressed in the Xenopus oocytes. Using two-electrode voltage clamp, membrane currents were recorded after application of L-glutamate (30 μM) in the presence or absence of various concentrations of gabapentin (1-300 μM). To study the effects of protein kinase C (PKC) and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) on gabapentin-induced change of EAAT3 activity, oocytes were pre-incubated with PKC activator (phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA), PKC inhibitors (chelerythrine or staurosporine) and PI3K inhibitor (wortmannin) before the application of 100 μM gabapentin. Data are reported as mean ± SEM. Statistical analysis was performed by one-way analysis of variance followed by the Tukey multiple comparison test. A P < 0.05 was accepted as significant. Gabapentin concentration-dependently decreased EAAT3 activity with an IC50 value (concentration required for 50% inhibition) of 0.65 μM. This inhibition reached statistical significance at 10-300 μM gabapentin. A kinetic study showed that gabapentin significantly decreased Vmax without changing Km. PMA, a PKC activator, increased EAAT3 activity. However, 100 μM gabapentin induced a similar degree of decrease in EAAT3 activity in the presence or absence of PMA. After pre-incubation of oocytes with two PKC inhibitors (chelerythrine or staurosporine), or PI3K inhibitor, wortmannin, basal EAAT3 activity was reduced and gabapetin even more inhibited the EAAT3 activity decreased by PKC inhibitors or PI3K inhibitor. In summary, we have shown that gabapentin reduced EAAT3 activity at clinically relevant and higher concentrations, PKC and PI3K may not be involved in the effects of gabapentin on EAAT3. According to these results, it looks unlikely that EAAT3 may be the main target for anticonvulsant and neuroprotective effects of gabapentin.;Gabapentin은 항경련과 진통 효과로 임상에서 많이 쓰이는 약물이며, 가장 주요한 약물학적 기전은 칼슘 이온 채널에 작용하여 glutamate를 포함한 신경전달 물질 분비를 억제시키는 것으로 알려져 있으나 아직까지 확실치 않다. Excitatory amino acid transporters (EAATs)는 중추신경계의 중요한 흥분성 신경전달 물질인 glutamate를 세포 내로 이동시켜 세포외액의 glutamate 농도를 조절하여 신경보호에 중요한 역할을 하게 된다. 또한 세포 안으로 이동된 glutamate은 GABA로 전환되며 EAAT3의 기능 장애는 경련, 신경 퇴행성 질환 등과 관련이 있다. 이에 본 연구에서는 gabapentin이 glutamate transporters에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. EAAT3가 발현된 Xenopus oocyte에 단계적인 농도로 (1-300 μM) gabapentin을 전 처치한 후 L-glutamate (30 μM)를 적용시켜 two electrode voltage clamp를 이용하여 막전류를 측정하였다. 또한 glutamate 농도에(3-300 μM) 따른 EAAT3 활성도 변화에 대한 gabapentin의 영향을 알아보고자, 100 μM Gabapentin 전처치 후 glutamate을 3-300 μM의 농도로 적용시켜 농도-반응곡선의 Vmax와 Km의 변화를 알아보았다. Gabapentin은 치료적 약물 농도에서 농도 의존적으로 EAAT3 활성도를 억제시켰고, glutamate 농도에 따른 EAAT3 활성도 반응에서 Km에는 영향이 없었으나 Vmax는 유의하게 감소시켰다. 이와 같은 gabapentin의 EAAT3 억제 효과에 protein kinase C (PKC)와 phosphatidyl inositol-3-kinase (PI3K) 경로가 관련되었는지 알아보기 위하여, PKC 활성약물인 phorbol 12-myristate-13-acetate (PMA) 100 nM, PKC 억제제인 staurosporine (2 μM)과 chelerythrin (100 μM) 및 PI3K 억제제인 wortmannin (10 μM)을 단독으로 혹은 gabapentin과 함께 전처치하여 막전류를 측정하였다. Gabapentin은 PKC와 PI3K 경로의 활성 혹은 억제와 상관없이 EAAT3 활성도를 억제시켰다. 본 연구에서 gabapentin은 임상에서 쓰이는 치료적 농도와 그보다 높은 농도에서 EAAT3 활성도를 유의하게 감소시키고 이 억제 효과에 PKC와 PI3K는 관여하지 않았다. 이 결과에 따르면 EAAT3는 gabapentin의 항경련 효과와 뇌보호 효과의 약리학적 작용부위는 아닌 것으로 생각된다.