Thermosensitive Polypeptide Hydrogel for Injectable Protein Delivery

Abstract

본 연구는 온도 변화에 따라서 졸-젤 전이가 일어나는 온도민감성 수화젤에 대한 것이다. 수화젤은 간단한 가공과 외과적인 수술 없이 바이오-프랜들리한 조건에서 약물을 전달 할 수 있는 전도 유망한 시스템 중 하나이다. 혈액 내에서의 짧은 반감기와 불안정성 때문에, 단백질 의약품은 일반적인 제제보다 서방형으로 약물이 방출 될 수 있는 제제가 선호된다. 단백질 의약품 중 하나인 성장 호르몬(hGH: Human growth hormone)은 191개의 아미노산으로 구성된 22kDa 의 분자량을 갖는 뇌하수체 전엽에서 분비되는 내분비 호르몬이다. 성장 호르몬(hGH)은 성장 호르몬 결핍으로 인한 저 신장 어린이, 만성 신부전증, 터너 증후군 등의 치료에 이용된다. 이 약물은 3.8~4hr의 짧은 반감기를 가지고 있어서 성장 호르몬 결핍증을 가진 아이들은 매일 혹은, 주 3회씩 26~43UG/Kg을 몇 년 동안 피하 주사해야 한다. 이러한 짧은 반감기와 빈번한 주사, 시장의 수요에 의해 성장호르몬(hGH)의 서방형 약물 방출 시스템의 개발이 자동적으로 필요하게 되었다. 본 연구 프로젝트는 성장호르몬(hGH)의 서방형 방출을 위한 폴리 펩타이드 기반의 온도 민감성 수화젤을 합성하는 것이다. 폴리(에틸렌 글리콜)-block-폴리(알라닌-co-페닐알라닌) (PEG-PAF)는 폴리 펩타이드를 바탕으로 한 고분자로 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 친수성 블록으로 작용하고, 펩타이드(PAF)가 소수성 블록으로 작용한다. 이것은 고리 열개 중합 방법으로 합성하였으며, PEG-PAF 수용액의 졸-젤 전이의 주요 메커니즘은 소수성 작용기를 갖는 폴리 펩타이드가 코어를 만들고, 친수성을 갖는 PEG가 쉘을 형성하면서 코어-쉘 구조의 마이셀을 이루게 되는 것이다. 친수성/소수성 작용기의 비율을 미세 조정하여 온도 민감성 수화젤인 PEG-PAF를 만들 수 있다. PEG-PAF는 1H-NMR 과 GPC로 분자량을 확인 하였다. 또한, FT-IR 분광기와 CD-ORD 스펙트라를 이용하여 이차 구조를 확인 하였다. TEM과 DLS를 이용하여 마이셀이 형성 되는 것과 온도 변화에 따른 크기 분포를 확인 하였다. 고분자는 물에서 비교적 안정적이며 분자량 변화도 거의 없었다. In vitro 실험에서 수용액의 pH는 한 달간 동일하게 유지하였고, 저장 및 pH와 관련된 안정성 실험은 자신의 분해 산물로 산을 생성하는 다른 온도민감성 고분자와 차이점을 갖는다. PEG-PAF 수화젤은 단백질 의약품의 전달에 응용하기 위해 주사제로 연구되었다. 안정화제와 재 조합된 인간 성장 호르몬을 PEG-PAF 수용액과 혼합한 후, SD 래트의 피하증에 주사하였다. 혼합된 수용액은 체온에서 졸-젤 전이가 일어나고, 생성 된 젤은 성장 호르몬(hGH)을 4일 동안 치료 유효 농도에서 서서히 방출하게 된다. 이 고분자 젤은 주사 후, 15일이 되면 피하 층에서 완전하게 제거된다. PEG-PAF를 주사한 래트의 피하 조직을 헤마토자일린과 에오신으로(H&E) 염색하여 이 수화젤이 생물학적으로 매우 적합하다는 것을 확인 하였다. PEG-PAF의 분자량은 단백질 약물을 전달하는데 매우 중요한 역할을 한다. 하나의 매개 변수 작용하는 분자량을 고려하여 PEG-PAF를 합성하였다. 각 고분자의 분자량 비율은 다음과 같다. PEG-PAF 1k-0.7k, 2k-1k, 5k-2.5k. 각각의 고분자의 분자량, 이차 구조, 마이셀 크기 등을 비교 분석하였다. in vitro 연구결과, 성장호르몬(hGH)의 저장 안정성은 PEG-PAF의 분자량이 큰 경우에 한 달 이상 지속되었다. 성장 호르몬의 지속적인 방출 작용도 분자량이 증가한 경우에 1주일 까지 연장되었다. 고분자의 생체 내 분해는 겔 투과 크로마토 그래피(GPC) 분석을 통해 진행 하였고, 우리의 이전 연구에서 보고한 바와 같이 PEG-PAF가 효소로 인한 분해되는 것을 확인 하였다. 또한, H&E 염색 결과에서도 분자량이 증가한 PEG-PAF를 래트의 피하층에 주사하였을 때도, 조직 적합성은 유지되었다. 요약하면, 이 논문은 폴리 펩타이드 기반의 수화젤을 합성하고, 여러 가지 기술을 이용하여 특성 분석 및 안정성 실험을 진행한 것이다. 이 폴리 펩타이드 기반 온도민감성 젤은 성장 호르몬(hGH)에 대한 잠재적인 주사 지속적인 저장소 역할을 하며, 분자량의 크기에 따라 지속성을 조절 할 수 있다.;A thermogel is an aqueous polymer system that undergoes solution (sol) to gel transition reversibly with the change in temperature. Thermogels prepared under biofriendly conditions are promising biomaterials due to simple fabrication, biodegradability, and non-surgical implantation. These thermogelling systems are showing promising results as drug delivery carriers in clinical trials leading to more demand these days. Sustained-release formulations of protein drugs are preferred over conventional formulations because of shorter half-life and instability of the protein drugs. Human growth hormone (hGH) is a protein containing 191 amino acids with molecular weight 22 KDa and originally an endocrine hormone secreted from the anterior pituitary gland. hGH has been used in children with short stature that results from growth hormone deficiency (GHD) chronic renal insufficiency, turner syndrome etc. The drug has half-life of 3.84 hr, and at a daily dose of 2643 g/kg through daily or three times per week subcutaneous injection for children with GHD has been used for several years. Thus short half-life, frequent injection, and market demand automatically necessitate the development of hGH sustained-release formulation Hence, research project was undertaken to synthesize a polypeptide based thermogel followed by its application for sustained-release delivery of hGH. PEG was used as the hydrophilic block while polypeptides acted as hydrophobic blocks. Thus poly (ethylene glycol)-block-poly(alanine-co-phenylalanine) (PEG-PAF) was synthesized by ring opening polymerization. The key mechanism of solgel transition of the PEG-PAF aqueous solution is the core-shell micelle formation in which the polypeptide being hydrophobic remains as the core while the PEG representing hydrophilic block accommodates itself in the shell form. Thus the fine tuning between the hydrophilic and hydrophobic blocks was carefully balanced to achieve the thermogelling behavior of PEG-PAF. The molecular weight of synthesized PEG-PAF was confirmed by 1H-NMR and GPC. Further characterization using FTIR and circular dichroism data supported the secondary structure of the PEG-PAF. TEM images and DLS studies confirmed the micelle formation and the size distribution of thermogel due to change in temperature. The polymer was quiet stable in water and therefore its molecular weight did not change significantly. The pH of the aqueous solution was maintained constant for one month during in vitro study. These stability studies (storage and pH) make PEG-PAF special from other thermogelling polymers which generate acid as their degradation product. This PEG-PAF thermogelling system was evaluated as an injectable implant for protein drug delivery application. Recombinant human growth hormone were mixed with aqueous solution of PEG-PAF (sol state) and then injected to subcutaneous layer of SD rats. Due to the body temperature, the solgel transition occurred and the resulting gel held the therapeutic hGH for longer time and showed 4 days release profile with therapeutic effective concentration of hGH. The polymer gel was completely eliminated from the implanted site after 15 days. A haematoxylin and eosin (H&E) staining study suggested good biocompatibility of the PEG-PAF in subcutaneous layer of rats. The molecular weight of PEG-PAF plays a crucial role in the drug delivery of protein drugs. Considering this parameter, PEG-PAF with different molecular weights was synthesized. Comparative analysis of polymers ensured the required molecular weight, secondary structure, and micelle size. The in vitro storage stability study of hGH suggested that hGH was stable over one month even in presence of high molecular weight of PEG-PAF. The sustained delivery of hGH was prolonged up to one week maintaining the efficacy of hGH (> 15 ng mL-1) even after the increase in the molecular weight of PEG-PAF. Gel permeation chromatographic analysis suggesting the in vivo degradation of polymers confirmed our previous claim that the degradation of PEG-PAF occurs due to enzymes. The result from H&E staining study suggested that increased molecular weight of PEG-PAF was able to maintain the histocompatibility in rat subcutaneous layer. Briefly, this thesis describes the synthesis of polypeptide based thermogels, their complete characterization using several techniques followed by its stability studies. Furthermore, this polypeptide based thermogel was developed as potential injectable sustained delivery depot for hGH.