ST3GalV 유전자 변이 기능 검색 및 갑상샘눈병증 간의 연관성 연구

Abstract

강글리오시드는 복합 지질 가운데 시알산을 가지고 있는 당지질로서 척추동물의 세포막과 중추 신경계에 많이 분포하고 있다. 강글리오시드는 체내에서 여러 효소의 도움으로 합성되며, 세포의 증식 및 분화, 신호 전달 등에 중요한 역할을 한다. 그 효소 중의 하나인 ST3GalⅤ(lactosylceramide α-2,3-sialytransferase 5)는 ST3Gal 과 중의 하나로 lactosylceramide로부터 GM3 강글리오시드를 생성하는 데 관여하는 효소이다. ST3GalⅤ는 체내에 골고루 분포하며 특히 중추신경계 내의 발현이 높다. 선행 동물 실험을 통해 ST3GalⅤ은 인슐린 감수성, 청력 유지 등 체내에서 다양한 역할에 관여하는 것으로 알려졌으나 아직까지 ST3GalⅤ 유전자 변이와 인체 질환 간의 연관성 연구는 많이 수행되지 않았으며 특히 한국인을 대상으로 수행된 ST3GalⅤ 유전자 변이 연구는 보고된 바가 없다. 갑상샘눈병증은 갑상샘의 자가면역질환인 그레이브스씨 병 환자에서 동반될 수 있는 안과적 질환으로, 총 그레이브스씨 병 환자 중 약 25~50% 정도가 임상적으로 의미 있는 눈병증으로 진단된다. 최근 한국인을 대상으로 한 연구에 따르면 ST3GalV 유전자 변이에 따른 발현 및 그 기능적 차이가 갑상샘눈병증의 감수성에 관련 있을 것으로 생각되나 이에 대한 연관성 연구는 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구는 한국인에서 ST3GalⅤ의 새로운 유전자 변이를 발굴하고 각 변이 유전자의 기능을 분자세포 실험을 통해 알아보고자 하였으며 ST3GalⅤ 유전자 변이가 갑상샘눈병증의 감수성과 유의한 연관이 있는 지 알아보았다. 먼저, ST3GalV 유전자 변이의 종류 및 빈도를 알아보기 위해 건강한 한국인 여성 48명으로부터 수집한 DNA 시료를 이용하여 promoter와 coding 부위 전체를 분석하였고 일배체형을 재구성하였다. 각 변이 유전자의 기능을 promoter 활성 측정을 통해 알아보았고, ST3GalⅤ promoter 변이 유전자의 전사 조절에 관여하는 전사 인자를 전사 인자 결합 위치 분석 및 젤 지연 분석법을 통해 알아보았다. 마지막으로, ST3GalⅤ 변이 유전자가 한국인에서 갑상샘눈병증의 감수성과 연관성이 있는지 알아보고자 50명의 한국인 갑상샘눈병증 환자로부터 얻은 DNA 시료를 이용하여 ST3GalⅤ 유전자를 분석하였고 환자군과 대조군 간 ST3GalⅤ 유전자 변이의 종류 및 빈도 차이를 비교하였다. 연구 결과, 건강한 한국인에서의 ST3GalⅤ promoter 부위와 coding 부위에서 각각 6개, 9개의 유전자 변이를 찾았다. 4개의 주요 ST3GalⅤ promoter 일배체형 중 일배체형3이 reference와 비교하였을 때 promoter 활성이 60% 감소함을 확인하였다. 이러한 일배체형3의 감소된 promoter 활성은 이 일배체형을 구성하는 4개의 변이 유전자 중 g.-1626G>A, g.-1051G>C, g.-141T>C와 같은 3개의 변이 유전자의 감소된 활성에 기인됨을 알 수 있었으며 각각 reference에 비해 74%, 36%, 50% 감소된 promoter 활성을 나타냈다. 전사 인자 결합 위치 분석과 젤 지연 분석법을 통하여 g.-1626G>A, g.-1051G>C와 g.-141T>C 변이 유전자 위치에 각각 sex-determining region Y gene(SRY)와 activating protein-1(AP-1) 그리고 hepatic leukemia factor(HLF) 전사 인자가 결합하며 유전자 변이 유무에 따라 결합력이 차이를 나타냄을 확인하였다. ST3GalⅤ 유전자 변이와 갑상샘눈병증 간의 연관성 연구 결과, 환자군과 대조군 간에 유의한 빈도 차이를 보이는 ST3GalⅤ 유전자 변이 또는 일배체형은 없음을 확인하였다. 결론적으로, 본 연구에서는 한국인에서 처음으로 ST3GalⅤ 유전자 변이를 발굴하였고 ST3GalⅤ promoter 변이 유전자의 기능 및 전사 조절 인자를 분자세포 실험을 통하여 밝혔다. 본 연구에서 찾은 기능성 ST3GalⅤ 변이의 임상적 유용성 평가를 위해서는 다른 인체 질환을 대상으로 한 연관성 연구가 추가적으로 필요할 것으로 생각된다.;Gangliosides, are sialic acid-containing glycosphingolipids distributed on the plasma membrane of vertebrate cells, and in the central nervous system. They are synthesized in the body by several enzymes and play important roles in the proliferation and differentiation of cells and cell signaling. ST3GalV (lactosylceramide α-2,3-sialytransferase 5) is a member of the sialyltransferase family and plays an important role in the synthesis of the GM3 gangliosides. ST3GalV is ubiquitously distributed in the body, and is particularly abundant in the central nervous system. Animal studies have shown that the loss, or decreased function, of ST3GalV was associated with enhanced insulin sensitivity and complete hearing loss. However, to date few studies have been performed to investigate the association between the genetic variation of ST3GalV and human diseases. To the best of my knowledge, ST3GalV genetic variants in Koreans have not been previously studied. Graves' ophthalmopathy, a disorder affecting the orbit, could be found in the patients with Graves’ disease, which is an autoimmune disorder of the thyroid glands. It is known that clinically evident Graves' opthalmopathy is developed in 25-50% of the patients with Graves’ disease. A recent study performed in Korea suggests that the change of expression or function of ST3GalV can have an impact on susceptibility to Graves' ophthalmopathy. This study was performed to identify genetic variants of ST3GalV in Koreans and to determine their functional effects. The association between genetic variations of ST3GalV and Graves' ophthalmopathy was determined. The promoter and coding region of ST3GalV was amplified and analyzed through direct sequencing using genomic DNA samples from 48 healthy Korean women. The promoter activity of ST3GalV variants was then measured using a luciferase reporter assay. Transcription factors that could be involved in the regulation of ST3GalV variants were determined using sequence analysis to predict transcription factor binding sites (TFBS) and transcription factor binding was assessed by gel shift assays. There were four major haplotypes of ST3GalV in Koreans. Among them, the promoter activity of haplotype 3 was 60% lower than the reference haplotype. Three of four variants present in haplotype 3, g.-1626G>A, g.-1051G>C, and g.-141T>C, had promoter activities significantly decreased by 74%, 36%, and 50%, respectively. TFBS analysis and gel shift assays revealed variant-dependent binding of sex-determining region Y (SRY) to g.-1626G>A, activating protein-1 (AP-1) to g.-1051G>C and hepatic leukemia factor (HLF) to g.-141T>C. There is no genetic variant or haplotype of ST3GalV that is present at a significantly different frequency in patients with Graves' ophthalmopathy compared to those in control groups. In conclusion, the genetic variants of ST3GalV were identified and functionally characterized in this study. To my knowledge, this is the first study to identify functional variants of the ST3GalV in Koreans. Further association studies with human diseases would be necessary to determine the clinical utility of the functional ST3GalV variants found in this study.