Establishment of cell and mouse models for validation of gene mutations in Charcot-Marie-Tooth Disease

Abstract

Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) is the most common inherited peripheral neuropathy caused by the mutations in over 70 genes. CMT is a genetically and clinically heterogeneous disorder of inherited peripheral neuropathy characterized by distal muscle weakness, sensory loss and areflexia. Currently, application of whole exome sequencing (WES) has accelerated the identification of novel causative genes in Mendelian disease. In part I, a novel homozygous MPV17-R41Q mutation was discovered by WES form two Korean patients with CMT phenotype recently. The effects of the newly found MPV17 mutation (R41Q) on cellular feature were analyzed. To investigate the function of MPV17 gene in cellular level, the gene was silenced using small interfering MPV17-specific siRNA in mouse motor neuron-like hybrid cell line (NSC-34 cells). Knockdown of MPV17 gene reduced cell proliferation in NSC-34 cells. Also cell viability against H2O2 was reduced when MPV17 gene was abrogated. Microarray analysis for the gene expression profiling in NSC-34 showed that expression levels of several genes were changed in the absence of MPV17. To investigate the effect of novel homozygous MPV17-R41Q mutation, on cell growth and maintenance, wild type and several mutants (R41Q, R50Q, KM88-89ML and L143X) of MPV17 were cloned into N-terminal Myc-tagged expression vector. Overexpression of mutant proteins significantly reduced proliferations of NSC-34 compared to wild type MPV17. In addition, expression levels of oxidative phosphorylation system complex were reduced when MPV17 mutant proteins were overexpressed in HEK293 cells. Localization of MPV17 wild type and R41Q proteins detected by immunocytochemistry revealed that localization patterns of both the wild type and mutant MPV17 proteins were indistinguishable. These results implicate that both the absence of MPV17 and overexpression of mutant MPV17 attribute to the cellular integrity. In part II, transgenic mouse of HSP27-S135F, which is well known for genetic causative of an axonal form of CMT, was generated to provide an animal model for drug development. Wild type and HSP27-S135F gene were cloned into pcDNA3.1 (+)-HSP27. To produce transgenic mice of HSP27-S135F, the plasmid was injected into fertilized egg and the eggs were implanted to female mouse. To confirm the phenotypic aberration of transgenic mice, behavior test was performed. Rotarod test showed that several mice exhibit lowered motor performance, which is the typical clinical feature of CMT. This mouse model is a useful tool for evaluation of candidate drugs for axonal neuropathy or related disease. Further study on the function of MPV17 and application of HSP27-S135F transgenic mouse might provide therapeutic options.;유전성 말초신경병인 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease; CMT)은 상대적으로 발병률이 높은 희귀질환으로 2,500명 중 한 명의 빈도로 발생한다. 유전적 소인에 따라 발생하며 현재까지 70여 개 원인 유전자가 동정되었다. 최근 활발히 시행되고 있는 차세대 염기서열분석(NGS: Next Generation Sequencing)을 이용한 전체 엑솜 염기서열 분석법(WES: Whole Exome Sequencing)은 신규 원인 유전자 동정을 가속화시키고 있다. 이 질환의 유전적 이질성으로 인해 원인 유전자들의 각각에 대한 발병기전은 아직 확실히 밝혀지지 않아 근본적인 치료적 접근이 어려운 상태이다. 첫 번째 부분에서는 두 명의 CMT 한국인 환자에서 전체 엑솜 염기서열분석법(WES)을 이용하여 동정한 MPV17 유전자의 신규 동형접합 돌연변이(c.122G>A, p.R41Q)에 대하여 연구한 결과이다. MPV17 돌연변이(p.R41Q)를 가지는 두 명의 환자 모두 운동감각신경병증(sensory motor neuropathy)이 조기 발병하였고 신경전도속도 검사에서 전도속도가 느리게 나타나는 축삭형 운동감각신경병증상(axonal sensory motor neuropathy)으로 관찰되었다. MPV17 유전자의 돌연변이는 열성유전되며 간뇌증후군(hepatocerebral form of mitochondrial DNA depletion syndrome; MDDS), 간병변(hepatopathy), 각막 무감각증(corneal anesthesia) 또는 말초신경병증(peripheral neuropathy)을 초래한다. 정확한 발병기전은 확립되지 않았지만 MPV17 단백질은 미토콘드리아 유전자(mitochondrial DNA)와 밀접한 관계가 있는 것으로 알려지고 있다. MPV17 유전자의 부재나 돌연변이는 미토콘드리아 유전자(mitochondria DNA)의 감소, 활성산소종(reactive oxygen species)증가, 세포자살(apoptosis), 산화적인산화복합체(oxidative phosphorylation complex)의 발현 감소 와 기능상실이 유도된다고 밝혀지고 있다. 본 연구에서는 발견된 동형접합 MPV17 유전자의 돌연변이(R41Q) 에 의한 세포 내에서 CMT 병인적 특징과 연관성을 규명하고자 하였다. MPV17 유전자의 세포 내 영향을 알아보고자 MPV17 유전자 특이적 siRNA를 이용하여 마우스 운동 뉴런 세포인 NSC-34 세포 내 MPV17 유전자 발현을 감소(knockdown)시켰을 때, MPV17 의 감소는 NSC-34 세포주의 증식능력(cell proliferation)을 저하시켰다. 또한 활성산소종인 H2O2를 처리를 하였을 때 생존능력(cell viability)이 감소하는 것을 관찰하였다. 마이크로어레이(microarray analysis)를 통해 MPV17 유전자 발현이 감소된 세포의 유전자 발현분석(gene expression profiling)한 결과 MPV17 유전자의 발현이 감소되면 세포증식에 관련된 유전자발현이 감소하는 것을 확인하였다. 새롭게 발견된 동형접합 MPV17 돌연변이(R41Q)가 세포생장, 유지에 미치는 영향을 조사하고자 동물세포에서 발현할 수 있는 벡터(pCMV-Myc)에 MPV17 대조군(wild type)과 돌연변이(p.R41Q) 그리고 이전 논문들에서 발표된 다른 돌연변이 형(R50Q, KM88-89ML, L143X)들을 클로닝하였다. 이 MPV17 돌연변이 형들을 NSC-34 세포주 에서 과발현 시킨 뒤 세포 증식력(cell proliferation)에 미치는 영향을 측정하였는데 대조군과 비교하였을 때 4개의 MPV17 돌연변이 형들을 과발현 시키면 세포 증식력이 감소하는 것을 확인하였다. 또한 세포 내 에너지 생성원인 산화적인산화복합체(oxidative phosphorylation system complex: OXPHOS complex)의 발현이 감소하는 것이 관찰되었다. MPV17 대조군과 돌연변이(p.R41Q)형 단백질의 세포 내 위치를 확인하기 위해 면역세포화학염색법(immunocytochemistry)으로 관찰한 결과 미토콘드리아 마커가 동일한 위치에 존재함을 확인하였으며 두 단백질간 다른 점은 관찰되지 않았다. 본 연구결과를 통해 NSC-34 세포 내 MPV17 유전자의 부재나 동형접합 돌연변이 형(p.R41Q)이 과발현 됨에 의해서 세포 증식력(cell proliferation)의 감소를 유발하고 이러한 현상은 세포 에너지 감소에 의한 것이라 추정할 수 있다. 두 번째 부분에서는 CMT axonal sensory motor neuropathy 증상의 원인유전자로 밝혀진 HSP27의 S135F돌연변이(HSP27-S135F)에 영향에 대한 기능적 연구를 하고자 동물모델을 구축하였다. 동물세포에서 발현할 수 있는 pcDNA3.1(+)-HSP27 대조군과 S135F 돌연변이 형을 클로닝하였으며, 이것을 이용하여 HSP27-S135F 형질전환 마우스(transgenic mouse)를 제작하였다. 신경학적 병증의 유무와 시간에 따른 진행도를 알아보기 위해 rotarod를 이용하여 행동학적 운동능력검사(motor coordination, balance, ataxia)를 실시한 결과 대조군 그룹보다 현저히 운동능력이 떨어지고 앞 뒷다리의 구부정한 자세를 취하는 founder를 동정하였다. 위와 같이 이질적 유전형, 표현형을 보이는 CMT질환에서 발견된 MPV17 유전자변이(p.R41Q)에 대한 결과는 차후 발병기전 연구와 진단 및 치료적 접근 연구의 바탕이 될 수 있으며, 더불어 확립된 HSP27-S135F 동물 모델은 axonal sensory motor neuropathy의 병인적 메커니즘을 연구와 치료를 위한 신약후보물질 스크리닝에서의 유용한 모델로 사용 될 수 있을 것이다.