Acriflavine resistance regulator의 과발현에 의한 대장균의 유기용매내성 향상

Abstract

인간의 의식주와 밀접한 제품의 생산에 이용되는 여러 유기용매는 대부분 석유로부터 생산되고 있다. 화석연료의 고갈로 인해, 유기용매의 지속 가능한 생산을 위한 대안을 찾는 연구가 전세계적으로 활발히 진행되고 있다. 대체 방법 중 미생물 공정을 이용하여 바이오매스로부터 유기용매를 생산하는 것은 친환경적이며 지속가능한 대안이다. 그러나 미생물 공정으로 유기용매를 생산할 때는 유기용매에 대한 내성을 가진 균주를 개발하는 것이 중요하다. 본 연구에서는 Escherichia coli의 13 가지 유전자의 과발현 균주들의 유기용매내성(Organic solvent tolreances, OSTs)을 선별하여 acrR+ 균주의 OSTs가 향상됨을 발견하였다. n-hexane과 n-hexane/cyclohexane이 첨가되었을 때, ΔfadR ΔmarR 보다 acrR+을 포함하는 ΔfadR ΔmarR acrR+ 균주는 성장이 증가하였다. acrR+ 균주는 세포 내 축적된 n-hexane의 양이 wild type의 약 40%였고, ΔacrR 균주는 wild type의 약 121%였다. n-hexane/cyclohexane 혼합액이 있을 때, acrR+의 환원능력은 wild type의 2배 가량 높았다. Wild type, ΔacrR 균주, acrR+ 균주에서 Quantitative real-time PCR 분석 결과, AcrR이 포괄적 조절자(global regulator)인 MarRAB와 SoxRS의 발현을 억제함을 알 수 있었으며, ΔacrR 균주에서는 marRAB와 soxRS의 발현이 2배 내지 6배 이상 증가하였다. Electrophoretic mobility shift assay(EMSA)를 통해서 AcrR이 acrRAB, marAB, soxRS의 프로모터 부분에 결합하고 있는 것을 밝혔다. acrR+ 균주에서 soxS와 marB의 발현이 wild type보다 3배 이상 증가하였으므로, acrR+ 균주의 OSTs 향상은 soxS와 marB의 적당한 조절에 의해 이루어진 것으로 볼 수 있었다.;Acriflavine resistance regulator (AcrR) is a local transcription factor that regulates the expression of the acrRAB genes associated with the AcrAB-TolC multi-drug efflux pump. Screening of organic solvent tolerances (OSTs) with the overexpression of 13 genes in Escherichia coli revealed that the overexpression of acrR improved the OSTs. Overexpression of AcrR in a background strain of wild type E. coli and in the OSTs strain LMB015 (ΔfadR ΔmarR) led to a significant increase in cell growth (indicated as acrR+ and ΔfadR ΔmarR acrR+ strain, respectively) in the presence of n-hexane and n-hexane/cyclohexane. In the acrR+ strain, the intracellular solvent accumulation was lower than in the wild type strain (40 % of wild type) when cells were incubated with n-hexane. The reduction capacity of the cell membrane in the wild type strain was attenuated below 50 % of the control level in the presence of n-hexane/cyclohexane. This effect was recovered to control levels in the acrR+ strain. Quantitative real-time PCR analysis of RNA from the wild type, ΔacrR, and acrR+ strains showed that AcrR represses the transcription of the global regulator genes marRAB and soxRS, in addition to its own gene cluster acrRAB. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) demonstrated that AcrR binds directly to the promoter region of acrRAB, marAB, and soxRS, indicating that local regulator AcrR acts on global regulators to impact mar-sox-rob regulon. In the acrR+ strain, soxS expression was significantly upregulated compared to wild type. The observation that all genes associated with marRAB and soxRS are upregulated in the ΔacrR strain, and that there is only moderate induction of soxS (and marB) in the acrR+ strain, provides insight into how acrR overexpression confers bacteria OSTs and the control network of mar-sox-rob regulon.