The Role of Protein Phosphatase 2A (PP2A) in Pathogenesis of Alzheimer’s Disease

Abstract

아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein, APP)의 Swedish 돌연변이(K595N/M596L, APP-swe)는 beta-secretase(BACE)에 의한 APP의 비정상 분절을 증가시켜 조발성 알츠하이머 병(Alzheimer’s disease)과 타우 단백질(Tau protein)의 과인산화를 유발하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 전사체 분석 기술(deep transcriptome sequencing technique)을 이용하여 전반적인 유전자 발현에 있어 APP-swe의 영향을 분석하였고 이를 바탕으로 타우 단백질 인산화에 있어 protein phosphatase 2A(PP2A)의 B 소단위체(subunit) 특이 조절 기전에 대하여 연구하였다. 인간 교모세포종(glioblastoma) H4 세포에서 APP-swe를 발현시켰고 각각의 전사체에서 38 base pair로 구성된 약 7400만 read를 분석하였다. 그 결과, wild type과 비교하여 APP-swe에서 283개의 유전자 발현이 감소되어 있었고 348개의 유전자 발현이 증가되어 있었다. 또한, 알츠하이머 병의 중요한 조직학적 특징으로 알려져 있는 타우 단백질의 과인산화를 초래하는 kinase와 phosphatase 역시 APP-swe의 발현에 의해 조절되고 있었다. Glycogen synthase kinase 3β(GSK-3β), cyclin dependent kinase 5(CDK5), cAMP-dependent protein kinase A(PKA)의 발현은 증가되어 있었고 반대로 PP2A의 촉매 소단위체(catalytic subunit)와 몇몇의 조절 소단위체(regulatory subunit)의 발현이 감소되어 있었다. 이는 APP-swe의 과발현이 타우 단백질의 비정상적인 과인산화에 기여함을 나타내고 있다. PP2A는 타우의 주요 phosphatase로, 구조를 이루는 A 소단위체(structural A subunit)와 촉매활성을 보이는 C 소단위체(catalytic C subunit), 여러 종류의 B 소단위체(regulatory B subunit)로 이루어져 있다. B 소단위체는 기질과의 결합, 효소 활성도, 효소의 세포 내 위치 조절을 통해 PP2A 기능을 조절하는 것으로 알려져 있다. siRNA 실험을 통해 B 소단위체 중 PPP2R2A는 타우 단백질의 Ser-199, Ser-202/Thr-205, Thr-231, Ser-262, Ser-422의 탈인산화를 매개한다는 것을 확인하였다. PPP2R5D 발현을 감소시킨 실험에서는 타우 단백질의 Ser-202/Thr-205, Thr-231, Ser-422의 인산화가 감소되는 것을 관찰하였다. 더불어, GSK3β의 활성 억제에 관련된 Ser 9 인산화와 GSK3β kinase인 Akt의 활성을 유도하는 Thr-308과 Ser-473의 인산화가 증가를 확인하였다. 이는 PPP2R5D와 결합한 PP2A가 GSK3β 활성에 기여한다는 것을 나타내고 있다. 추가적으로 타우 단백질에 있어 B 소단위체 특이 인산화 위치를 질량 분석(Mass spectrometric analysis)을 통해서도 설명하였다. 액체 색층 질량 분석(Liquid chromatography-mass spectrometry, LC/MS)은 B 소단위체 의존적으로 타우단백질의 인산화 상태가 영향을 받고 있음을 보여주고 있다. 결론적으로, 본 연구를 통해서 APP-swe의 발현이 알츠하이머 병과 관련하여 전반적인 유전자 발현을 조절한다는 것을 알 수 있었다. 또한 APP-swe에 의해 유도된 유전자 발현 변화는 타우 단백질 과인산화에 기여하고 있다는 것을 알 수 있었다. 특히 본 연구에서는 여러 종류의 PP2A 조절 B 소단위체가 타우 단백질 인산화 조절에 다르게 영향을 미치고 있음을 보여주고 있다. 이는 타우 단백질의 인산화 상태와 특정 위치 인산화에 있어 다양한 B 소단위체의 기능을 이해하는데 도움을 주고 있다. 또한 PPP2R5D의 억제가 Akt 신호체계을 통해 타우 인산화를 감소시키고 있어 새로운 치료 개발에 있어 잠재적 타겟으로의 가능성을 제시하고 있다. ;The Swedish mutation (K595N/M596L) of amyloid precursor protein (APP-swe) has been known to increase abnormal cleavage of cellular APP by beta-secretase (BACE), which causes tau protein hyperphosphorylation and early-onset Alzheimer’s disease (AD). This study analyzed the effect of APP-swe in global gene expression using deep transcriptome sequencing technique, and on the basis of this analysis, characterized regulatory B subunit-specific regulation of tau protein phosphorylation. 283 down-regulated genes and 348 up-regulated genes were found in APP-swe expressing H4-swe cells compared to H4 wild-type cells from a total of approximately 74 million reads of 38 base pairs from each transcriptome. Through this analysis, the results propose that the expression of APP-swe modulates global gene expression directed to AD pathogenesis. Two independent mechanisms such as kinase and phosphatase signaling cascades leading hyperphosphorylation of tau, major components of neurofibrillary tangles, which are histopathological hallmarks of Alzheimer’s disease, were regulated by the expression of APP-swe. Expressions of tau-phosphorylating glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β), cyclin dependent kinase 5 (CDK5), and cAMP-dependent protein kinase A (PKA) catalytic subunit were increased. In contrast, expressions of catalytic subunit as well as several regulatory subunits of protein phosphatases 2A were decreased. These results indicated that overexpression of APP-swe causes abnormal hyperphosphorylation of tau protein. Protein phosphatase 2A (PP2A), a major tau protein phosphatase, consists of a structural A subunit, catalytic C subunit, and a variety of regulatory B subunits. The B subunits have been reported to modulate function of the PP2A holoenzyme by regulating substrate binding, enzyme activity, and subcellular localization. The current study showed that the PP2A B subunit PPP2R2A mediated dephosphorylation of tau protein at Ser-199, Ser-202/Thr-205, Thr-231, Ser-262, and Ser-422. Down-regulation of PPP2R5D expression decreased tau phosphorylation at Ser-202/Thr-205, Thr-231, and Ser-422, which indicates activation of the tau kinase glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3β) by PP2A with PPP2R5D subunit. The level of inhibitory phosphorylation at Ser-9 of GSK3β and the level of activating phosphorylation of the GSK3β kinase Akt at Thr-308 and Ser-473 were both increased by PPP2R5D knockdown. Mass spectrometric analysis also characterized B subunit-specific phosphorylation sites in tau. Liquid chromatography-mass spectrometry revealed that the phosphorylation status of the tau protein may be affected by PP2A, depending on the specific B subunits. In conclusion, the findings of this study present an effect of APP-swe mutant on transcriptional regulation related to pathogenesis of Alzheimer’s disease. Furthermore, the results suggest that APP-swe mutant mediates tau hyperphosphorylation through alterations in transcription. Moreover, PP2A regulatory B subunits are shown to different effects in regulating tau phosphorylation. That promotes further understanding of the function of various B subunits in mediating site-specific regulation and phosphorylation status of tau protein. Especially, inhibition of PPP2R5D reduces tau phosphorylation via modulation of Akt activity, suggesting can be considered as potential targets for new treatment strategies.