Establishment and applications of molecular method using cloned competitors for copy-number measurement

Abstract

Variations and alterations of copy numbers (CNVs and CNAs) carry disease susceptibility and drug responsiveness implications. Chromosomal abnormality is common disorder, resulting in severe mental retardation and multiple dysmorphic features. Although there are many molecular methods to measure copy numbers, sensitivity, reproducibility, cost, and time issues remain. In the present study, we were able to solve those problems utilizing our modified real competitive PCR method with cloned competitors (mrcPCR). First, the mrcPCR for ERBB2 copy number was established, and the results were comparable to current standard methods but with a shorter assay time and a lower cost. Second, the mrcPCR assays for 24 drug-target genes were established, and the results in a panel of NCI-60 cells were comparable to those from real-time PCR and microarray. Third, we established mrcPCR assay for the detection of aneuploidy, determined the chromosomal abnormalities in cases of trisomy 13, trisomy 18, trisomy 21, 45,XO and 47,XXY. Fourth, the mrcPCR results for FCGR3A and the FCGR3B CNVs were comparable to those by the paralog ratio test (PRT). These results suggest that mrcPCR is comparable to the currently available standard or the most sensitive methods. In addition, mrcPCR would be invaluable for measurement of CNVs in genes with variants of similar structures, because combination of the other methods is not necessary, along with its other advantages such as short assay time, small sample amount requirement, and applicability to all sequences and genes.;카피수의 다양성과 변형은 질병 감수성 및 약물 반응성에 영향을 미칠 수 있다. 염색체 이상은 일반적인 장애로, 중증 정신 지체 및 여러 기능의 이상을 초래한다. 비록 카피수 측정을 위한 많은 분자적인 방법이 존재한다 하더라도, 감도, 재현성, 비용 및 시간 등의 문제가 남아 있다. 본 연구에서는 클론된 competitors을 이용한 변형된 real competitive PCR (mrcPCR) 방법으로 이러한 문제를 해결할 수 있었다. 첫 번째로 ERBB2 카피수 측정을 위한 mrcPCR 방법을 확립하였고, 그 결과를 현재의 표준 방법과 비교하였다. 두 번째로, 24개의 약물 표적 유전자에 대한 mrcPCR 방법을 확립하여 NCI-60 세포 패널에서 조사하였고, 그 결과를 microarray 와 real-time PCR 방법과 비교하였다. 세 번째로, 이수체를 측정할 수 있는 mrcPCR 방법을 확립하여 trisomy 13, 18, 21 과 45,XO, 47,XXY에서 염색체 이상을 확인하였다. 네 번째로 FCGR3A 및 FCGR3B의 다양성을 측정하기 위한 mrcPCR 방법을 확립하였고, 그 결과를 paralog ratio test (PRT)의 결과와 비교하였다. 이러한 결과로 볼 때 mrcPCR 방법은 카피수 측정을 위한 일반적이며, 민감한 방법들과 대등한 결과를 보임을 확인 할 수 있었다. 더욱이 mrcPCR 방법은 분석 시간이 짧고, 적은 샘플 량이 필요하고, 모든 시퀀스와 유전자에도 적용 가능하며, 두 가지 이상의 방법이 필요하지 않는 장점을 가지고 있고 때문에 유사한 구조를 가지고 있는 유전자의 다양성 측정에 매우 유용하게 이용할 수 있다.