Studies on the regulation of NADPH oxidase in keratinocytes and hair follicle cells

Abstract

Several lines of evidence indicate that reactive oxygen species (ROS) are involved in the development of dermatological disease or skin aging. Various agonists including growth factors, hormones, and neurotransmitters stimulate ROS generation to mediate physiological responses, such as cell proliferation, differentiation, and cell death in different cell types. In this thesis, I revealed that the non-genomic action of testosterone stimulates ROS generation in keratinocytes and hair follicle cells. In Part I, I showed the cell signaling cascade by testosterone induces Duox1-dependent H2O2 generation in primary keratinocytes. To evaluate the non-genomic action of testosterone in primary epidermal keratinocytes, we first measured [Ca2+]i mobilization as hallmark of non-genomic action of testosterone. Stimulation of primary epidermal keratinocytes with testosterone resulted in rapid and transient [Ca2+]i mobilization within a minute. Stimulation of primary epidermal keratinocytes with testosterone revealed in significantly increased H2O2 generation within 5 min and then decreased after 30 min stimulation of testosterone. H2O2 generation by testosterone was diminished by DPI as a Nox inhibitor, but not by Flutamide as an androgen receptor antagonist. These results indicated that the H2O2 generation is independent from activation of AR. The knockdown of Duox1 enzyme, predominant Nox isozyme in keratinocytes, resulted in decreased H2O2 generation in response to testosterone stimulation. Moreover, I hypothesized that transient intracellular calcium mobilization by non-genomic action of testosterone affects Duox1-dependent H2O2 generation. The pretreatment of keratinocytes with BAPTA-AM as an intracellular Ca2+ scavenger resulted in significantly reduced testosterone-induced H2O2 generation, indicating that intracellular calcium mobilization by the non-genomic action of testosterone is coupled with Duox-dependent intracellular H2O2 generation. Recently, GPRC6A serves as a sensor and mediator of the rapid action of testosterone in epidermal keratinocytes. The silencing of GPRC6A inhibited testosterone-induced intracellular calcium ([Ca2+]i) mobilization and H2O2 generation. These results indicated that a testosterone-GPRC6A complex is required for the activation of Gq protein, IP3 generation, and [Ca2+]i mobilization, leading to Duox1 activation. H2O2 generation by testosterone stimulated the apoptosis of keratinocytes through the activation of caspase-3. The application of testosterone into 3-D skin equivalents increased the apoptosis of keratinocytes between the granular and stratified corneum layers. These data indicate that testosterone stimulates Duox1 activity through GPRC6A leading to cell death in skin keratinocytes. In Part II, to evaluate the effects of testosterone on hair cells, I used human primary outer root sheath (ORS) cells and primary dermal papilla (DP) cells of hair follicles. ORS cells of hair follicles are originated from epidermal keratinocytes, which mainly expressed Duox1 isozyme. In ORS cells, I found that testosterone stimulates intracellular calcium mobilization and H2O2 generation. In addition, the silencing of Duox1 or GPRC6A in ORS cells significantly reduced H2O2 generation and apoptosis in response to testosterone. DP cells which originated from fibroblast, mainly expressed Nox4. The silencing of Nox4 in DP cells resulted in reduced H2O2 generation in response to testosterone. Furthermore, I found that testosterone-induced hair loss was blocked by treatment of Nox inhibitor. These results support an understanding of the molecular mechanism of testosterone-dependent apoptosis in which testosterone stimulates H2O2 generation in hair cells, and they provide information for the therapeutic treatment of androgenic alopecia through Nox inhibition. ;활성산소종(Reactive oxygen species, ROS)은 유기호흡을 하는 생물에게 있어 필수적인 산소가 세포 내의 효소 그리고 대부분의 전자 운반 과정 혹은 에너지대사 과정 중에 불완전하게 환원되거나 펩티드 성장인자, cytokine들 및 다양한 작용의 자극에 의해 생성된다. 이 활성산소종은 free radical을 가져 안정되지 못한 상태를 말하며 그로 인해 강한 활성을 가진다. 최근 연구에 따르면 이러한 활성산소종이 다양한 피부질병이나 피부노화와 관련이 있으며, ‘산화 환원 항상성 (redox homeostasis)’ 의 유지는 세포가 잘 살아 가는데 매우 중요하다는 것이 보고되고 있다. 여러 성장인자, 호르몬, 신경전달물질 등을 포함한 다양한 작용물질들은 활성산소를 생성함으로써 다양한 세포에서 세포의 성장, 분화, 세포의 죽음과 같은 병리적 활성을 조절한다. 본 연구에서는, 피부의 각질형성세포와 모낭세포에서 남성호르몬인 테스토스테론이 비유전자적 경로 (non-genomic effects)를 통하여 활성산소를 생성하는 기작을 규명하고자 하였다. Part I 에서는, 상피각질형성세포에서 칼슘의 조절을 통하여 Duox이 활성산소종을 생성하는 테스토스테론의 비유전자적 활성을 살펴보았다. 피부각질세포에서 테스토스테론의 영향을 보기 위하여, 갓 태어난 C57BL/6J 쥐에서 피부세포를 분리하여 실험을 하였다. 분리해 낸 쥐의 상피각질세포에 테스토스테론을 처리 하였을 때, 매우 빠른 시간안에 활성산소가 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 테스토스테론에 의하여 증가하던 활성산소는 Nox의 저해제인 DPI 에 의해서는 현저히 감소하였으나, 남성호르몬수용체 (androgen receptor)의 저해제인 Flutamide 에 의해서는 변화를 보이지 않았다. 이를 통해 테스토스테론은 남성호르몬수용체를 통하지 않은 비유전자적 경로를 통하여 활성산소를 생성함을 알 수 있었다. 다음으로 어떤 Nox가 활성산소생성에 관여하는지를 알기 위해 상피각질세포에서 Nox isozyme의 발현을 확인해 보았다. 상피각질세포에 많이 발현되어 있는 Nox isozyme 인 Duox1을 Knockdown 하였을 때에 테스토스테론에 의해 증가하던 활성산소가 감소하는 것을 통하여, 활성산소의 매개체가 Duox1 임을 알 수 있었다. Duox 는 칼슘결합부위를 갖고 있기 때문에, 세포 내 칼슘의 이동이 Duox의 활성에 관여할 것이라 생각하고 FURA-2 AM 을 이용하여 칼슘을 측정해 보았다. 그 결과, 테스토스테론에 의하여 매우 빠르게 세포 내 칼슘 농도가 증가하였고, 칼슘의 생성을 막는 저해제에 의하여 활성산소가 감소하는 것을 볼 수 있었다. 최근 연구에 따르면, GPCR 중에 하나인 GPRC6A 수용체가 테스토스테론을 인식하여 비유전자적 활성을 매개한다는 보고가 되고 있다. 상피각질세포에서 테스토스테론의 비유전자적 경로에 GPRC6A가 관여하는지를 알아보기 위하여 GPRC6A를 knockdown 한 결과, 테스토스테론에 의해 증가하던 칼슘과 활성산소가\ 감소하였고, 하위 신호전달 단백질인 Gq 를 knockdown 하였을 때에도 활성산소가 감소하는 것을 관찰하였다. 또한 이노시톨 단인산염 (inositol monophosphate) 이 테스토스테론에 의해 단시간 내에 생성이 되는 것으로 보아, Gq 단백질을 통해 PLCβ — phosphatidylinositol 4–5 bisphosphate (PIP2) — IP3 가수분해 과정이 일어나는 것을 알 수 있었다. 이러한 경로로 테스토스테론에 의해 생성된 활성산소는, 상피각질세포의 사멸을 유도하였다. 이러한 세포사멸은 caspase-3 를 통하여 일어나는 것을 확인하였으며, Duox1과 GPRC6A를 knockdown 하였을 때에는 이러한 세포사멸이 감소하는 것을 관찰하였다. 이러한 결과는 테스토스테론이 Duox1과 GPRC6A를 통하여 상피각질세포의 사멸을 유도한다는 것을 제시한다. Part II 에서는, 테스토스테론이 모낭세포에 미치는 영향을 규명하기 위하여, 사람의 외모근소세포 (primary outer root sheath cells) 와 진피유두세포 (primary dermal papilla cells) 를 사용하였다. 모낭의 ORS 세포는 상피각질세포로부터 유래된 세포이며, Duox1이 주로 발현되어 있다. ORS 세포에서는 테스토스테론에 의한 칼슘의 증가와 활성산소의 생성에서 상피각질세포에서와 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 또한, Duox1과 GPRC6A가 knockdown 된 ORS 세포에서는 이러한 활성산소의 생성과 세포사멸이 감소된 것을 볼 수 있었다. DP 세포는 섬유아세포 (fibroblast) 로부터 유래된 세포이며, Nox4를 주로 발현하고 있다. DP cell에서도 테스토스테론에 의하여 빠른 시간 안에 활성산소가 증가하는 것을 보았고, Nox4를 knockdown 하면 이렇게 생성되는 활성산소가 감소하는 것을 관찰하였다. 또한, microarray 분석을 통하여, DP 세포에서 테스토스테론에 의하여 증가하는 유전자들을 확인해 보았다. 더 나아가, 동물실험을 통하여 테스토스테론이 남성형탈모를 일으키는 것을 확인하였고, 이는 Nox 의 저해제에 의하여 저해되는 것을 관찰하였다. 이러한 결과는 모발세포에서 테스토스테론에 의해 활성산소가 증가하고, 세포사멸이 유도되는 분자적 기전의 이해를 뒷받침하고 있으며, 뿐만 아니라 Nox의 저해를 통한 남성형 탈모의 치료 가능성을 시사하고 있다.