Function of Ahnak protein in BMP2-mediated adipocyte differentiation

Abstract

Obesity is caused by imbalance of energy homeostasis and adipogenesis. Adipose tissues have a function as not only energy storage site, but also endocrine gland producing numerous hormones and adipokines. Ahnak is a nuclear phosphoprotein with the estimated molecular mass of 700 kDa that contains 36 central repeated units (CRUs). Ahnak contains three distinct structural regions: the NH2-terminal 251-amino acid region, a large central region of about 4300 amino acids with 36 repeated units, and the COOH-terminal 1002 amino acids region. Because of unique 36 central repeated units (CRUs), Ahnak has been proposed to be a scaffolding protein in cellular signaling. Ahnak is known to be involved in actin cytoskeleton rearragement in some cell types, calcium homeostasis, and activation and proliferation of T cells. We have previously reported that the central repeated region of Ahnak binds and activates phospholipase C-γ1 and PKC resulting intracellular calcium mobilization and Erk activation in response to PDGF. Thus, Ahnak appears to function as a molecular linker for calcium homeostasis and Erk activation pathway in response to growth factors. To investigate physiological functions of Ahnak, I analyzed phenotypes in Ahnak-deficient mice (Ahnak-/-). Although size of Ahnak knockout mice was smaller than wild type, food consuming was not changed. I challenged high fat diet to Ahnak-/- mice and analyzed weight gain and adipocyte tissues generation. Weight gain of Ahnak-/- mice was significantly reduced compared wild type and heterozygotes during high fat diet. Epididymal fat size and white adipocyte tissue of Ahnak-/- mice were reduced. Although adipogenic stimulation resulted in increased Ahnak expression, 3T3-L1 preadipocyte cell lines overexpressing 4CRUs of Ahnak (3T3-L1-Ahnak) were established to understand the function of Ahnak in differentiation of adipocyte cells. 3T3-L1-Ahnak cells were more differentiated to mature adipocytic cells. Moreover, transfection of C3H10T1/2 pluripotent stem cells with Ahnak siRNA resulted in inhibited differentiation of adipocytes. Based on our previous data that Ahnak promotes TGFβ-Smad3 signaling, I hypothesized whether Ahnak protein serves as novel molecular linker that modulates the adipocyte differentiation in response to BMP2. I found that Ahnak stimulates Smad1 phosphorylation and localization into nucleus in 3T3-L1-Ahnak cells compared to control cells. C3H10T1/2 pluripotent stem cells lacking Ahnak protein failed to differentiate adipocytes in response to BMP2. These results indicated that Ahnak protein plays an important role in BMP2-mediated adipogenesis. Adipocyte is well-known to be committed and differentiated from mesenchymal stem cell. To evaluate the activation of BMP2-Smad1 signaling in Ahnak-/- mice, I isolated mesenchymal stem cell from adipose tissue (ADSC) from wild type and Ahnak-/- mice. Stimluation of ADSC lacking Ahnak protein with BMP2 failed to locate Smad1 into nucleus and to differentiate adipocyte. The result indicated that Ahnak plays an important role in adipocyte differentiation. During differentiation of ADSC to mature adipocyte, PPARγ functions as regulator for fatty acid storage and glucose metabolism. Transfection of C3H10T1/2 pluripotent stem cells with Ahnak siRNA resulted in reduced PPARγ expression leading to that DNA binding activity of Smad1 to Smad1-binding site (SBE) of PPARγ promoter region was inhibited. Our findings suggested that Ahnak regulates adipogenesis through the regulation of Smad1-dependent PPARγ expression. In addition, profiling of gene chip in ADSC in the absence or presence of BMP2 provides information regarding on Ahnak-regulated genes participating in not only lipid metabolism, but also cytoskeleton remodeling related to inflammatory response. Recently, obesity has been considered as chronic inflammation and disruption of cytoskeleton which is known to be required during adipocyte differentiation. The data suggested that Ahnak might be involved in adipocyte differentiation through chronic inflammation and disruption of cytoskeleton. Lastly, differential expression pattern of genes involved in adipogenesis and energy balance was examined in white adipose tissue (WAT) as well as brown adipose tissue (BAT) of Ahnak-/- mice. I found that BAT-specific genes including Prdm16 and UCP1 were increased in WAT derived from Ahnak-/-mice suggesting that increased energy expenditure of Ahnak-/- mice was partly involved in acquisition of BAT-derived genes in WAT. Taken together, I propose that Ahnak protein regulates adipocyte differentiation and energy homeostasis through Smad1 signaling.;비만과 그 외 여러 대사 질환들은 에너지 항상성과 지방 조직을 구성하는 지방 세포의 분화의 불균형으로 인해 야기된다. 지방 조직은 단순히 에너지의 저장 창고로서의 역할 뿐 아니라 에너지 균형 및 다양한 과정들에서 필요한 많은 호르몬과 adipokine들을 생성하는 내분비선으로서도 중요한 역할을 한다. Ahnak은 약 700kDa에 이르는 거대한 단백질로서 그 크기로 인해 유대어로 “거인(giant)”라는 의미를 갖는 이름을 갖게 되었으며, 3개의 구조적 domain으로 구성된다. 251개의 아미노산으로 이루어진 NH2-말단과1002개의 아미노산으로 이루어진COOH-말단 그리고, 거대한 4300개 아미노산으로 구성되어 있는 중앙부위를 지니는데, 이 중앙부위는128개의 아미노산이 36번 반복되는 특이한 구조를 지닌다. Ahnak은 actin 세포골격(cytoskeleton)의 재배열과 칼슘의 항상성, 그리고 T 세포의 황성과 증식에 기여한다고 알려져 있으며, 우리는 사전 연구를 통해 Ahnak의 중앙반복구조(central repeated unit, CRU)가 PDGF 자극에 따라phospholipase C-γ1과 PKC를 활성하여 세포내의 칼슘을 이동시키고 Er를 활성화한다는 보고를 한 바 있다. Ahnak의 역할에 대해 더욱 알아보기 위해, 나는 Ahnak유전자가 결핍된 마우스를 만들어서 그 표현형을 분석하였다. 흥미롭게도, Ahnak 결손 마우스(Ahnak-/- mice)는 대조군(wild type mice)에 비하여 성장이 지연되고 지방의 무게가 감소되어 있는 것을 볼 수 있었다. 우선 나는 Ahnak 이 몸무게 감소에 미치는 영향을 에너지 항상성의 관점에서 설명하기 위해 마우스에 고지방 식이를 먹였는데, Ahnak 결손 마우스와 대조군의 먹은 양에는 차이가 없었지만 산소 소비량과 체온 생성과 같은 에너지 소비의 척도에서 Ahnak 결손 마우스가 높은 수치를 보였으며 그 결과 더 적은 몸무게의 증가를 나타내었다. 지방 조직을 구성하는 지방세포의 크기가 작은 것 역시 Ahnak 결손 마우스의 지방 감소에 영향을 주었다. 지방선구세포주(preadipocyte)나 지방에서 유래된 줄기세포(adipose-derived stem cell, ADSC)에 지방 세포로의 분화를 유도하는 자극을 주었을 때, Ahnak의 발현이 증가하는 것을 통해 나는 다양한 세포주에서 Ahnak과 지방세포 분화와의 상관관계를 살펴보았다. Ahnak의 중앙반복구조(4CRUs)를 과발현한 3T3-L1 지방선구세포주는 성숙한 지방세포로 더 잘 분화하지만, Ahnak의 발현을 억제한 C3H10T1/2 다능성 줄기 세포주의 경우 지방세포로의 분화가 억제되는 결과를 보였다. 이전의 연구를 통해 Ahnak이 TGFβ-Smad3 신호전달을 활성화시킨다는 것을 알 수 있었기 때문에 나는 발생과정에서 세포의 분화를 담당하는 TGFβ과 중 하나인 BMP2가 Ahnak이 매개하는 지방세포분화에 관여할 것이라는 가설을 세웠다. Ahnak이 BMP2신호전달에서 갖는 기능을 알아보기 위해 Ahnak의 중앙반복구조 (4CRUs)와 BMP2 신호전달의 R-Smad인 Smad1을 이용하여 면역 침강 (immuno-precipitation)을 수행하였으며 그 결과 Ahnak과 Smad1은 서로 결합하고 그 결합은 BMP2자극에 따라 더 증가함을 알 수 있었다. 또한 Ahnak의 기능 강화와 기능 억제연구를 통하여 Ahnak이 Smad1의 인산화, 즉 활성화와 핵으로의 이동을 촉진한다는 것을 관찰하였다. 지방세포는 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)에서 유도 및 분화된다는 것이 매우 잘 알려져 있기 때문에 나는 Ahnak결손 마우스와 대조군의 지방조직에서 분리한 줄기세포를 이용하여 BMP2-Smad1 신호 전달의 활성화를 재현해내었다. 그 결과 Ahnak이 발현되지 않는 줄기세포는 BMP2에 의한 지방세포로의 분화가 잘 이루어 지지 않는 것을 확인하였고 이를 통해 Ahnak이 단지 지방세포로의 분화능을 유지하는 역할을 할 뿐 아니라 분화 중 BMP2에 의한 긍정적 영향에 민감하게 반응할 수 있도록 하는데 중요하다는 것을 볼 수 있었다. 줄기세포가 지방세포로 분화되는 동안, 지방산 저장과 당 대사를 조절하는 PPARγ의 발현이 증가한다는 것이 보고 되어 왔다. 나는 Ahnak의 발현이 억제된 세포가 분화될 때에는 PPARγ의 증가가 억제되는 것을 관찰하였고, 뿐만 아니라 PPARγ의 전사를 조절하는 Smad1의 PPARγ의 촉진제(promoter)에 대한 결합이 감소된다는 것을 알았다. 이는 Ahnak이 Smad1의 PPARγ전사 조절에 관여함으로서 지방세포로의 분화를 매개한다는 것을 보여준다. 줄기세포가 지방세포로 분화를 시작할 때에 수행한 microarray 유전자 프로파일링은 나에게 Ahnak이 조절하는 직접적인 지방 대사 관련 유전자뿐 아니라 면역 반응이나 세포골격 재배열 등에 관여하는 여러 유전자에 대한 방대한 정보를 제공하였는데, 비만이 만성 염증으로 여겨지고 있고 지방세포 분화 동안에는 세포골격의 붕괴가 요구되기 때문에 나는 Ahnak이 다양한 측면에서 지방세포 분화에 관여한다는 것을 추측할 수 있었다. 이와 관련하여 백색 지방과 갈색 지방에서 지방세포 분화와 에너지 균형에 관여하는 여러 유전자들의 발현을 확인하였는데 Ahnak결손 마우스의 백색지방에서 leptin에 대한 민감도가 증가되어 있음을 확인할 수 있었다. 또한 갈색 지방에 특이적으로 발현되는 유전자인 Prdm16과 UCP1이 Ahnak 결손 마우스의 백색지방에서 대조군에 비해 증가되어 있음을 볼 수 있었는데, 이는 Ahnak 결손 마우스의 증가된 에너지 소모율의 원인이 백색 지방세포이 갈색지방의 특성을 획득 한 것에 일부 있음을 보여준다. 따라서 본 연구 결과로 미루어 볼 때, Ahnak 단백질이 지방세포 분화와 에너지 항상성을 모두 조절 함으로서 지방 조직의 축적을 관리하는 역할을 한다고 생각된다.