Engineering substrate binding domain of fatty acid-cleavage enzymes

Abstract

Fatty acids are one of the most widely used substrates in biocatalysis. However, poor solubility and dispersability in the aqueous reaction media often limits catalytic performance of fatty acid transformation enzymes. Here, we report a novel method to increase catalytic activity of an esterase by introducing a presumed substrate-binding domain. The primary structure of an esterase from Bacillus subtilis DSM 402 (BS2) is similar to Pseudomonas fluorescens DSM 50106 (PFEII) (amino acid sequence identity: 39%) rather than that of Pseudomonas fluorescens WI SIK (PFEI) (amino acid sequence identity: 26%). However, the reaction kinetics with respect to ethyloctanoate, octylacetate, and the ester 3 was closer to that of PFEI. For instance, the kcat value of BS2 with 3 was similar to that of PFEI (i.e., ca 90 s-1), which is 7 -folds lower than that of PFEII. Furthermore, fusion of PFEI with the N-terminal hydrophobic domain of PFEII led to a substantial increase (i.e., ca. 6-folds increase in the kcat value) of the hydrolytic activity with 3. These results indicate that the N-terminal domain of PFEII, which is assumed to be involved in anchoring to the cytoplasmic membrane, interacts with fatty acid-like substrates resulting in an improvement of enzyme activity. Therefore, we conclude that the membrane-anchoring domains can be used to increase catalytic activity of fatty acid transformation enzymes. ;지방산은 생촉매 반응에서 가장 널리 쓰이는 기질중의 하나이다. 그러나, 수성 반응 매질에서 낮은 용해도와 분산성은 종종 지방산 전환 효소의 반응을 저해하는 요소로 작용한다. 이번 연구에서는 기질 결합 도메인을 도입함으로써, 에스터레이즈의 촉매활성을 증가시키는 새로운 방법을 연구하였다. 단백질의 1차 구조는 Bacillus subtilis DSM 402 (BS2) 유래 에스터레이즈가 Pseudomonas fluorescens DSM 50106 (PFEII)유래 에스터레이즈와 39%의 유사성을 보였으며, Pseudomonas fluorescens WI SIK (PFEI)유래 에스터레이즈와 26%의 유사성을 보였다. 그러나, B. subtilis DSM 402 (BS2) 유래 에스터레이즈의 ethyl octanoate, octyl acetate 그리고 ester 3에 대한 반응속도는 P. fluorescens WI SIK (PFEI) 유래 에스터레이즈 (i.e., ca 90 s-1)와 비슷한 결과가 나타났고, P. fluorescens DSM 50106 (PFEII)유래 에스터레이즈보다는 대략 7배 낮은 활성을 보였다. 더욱이, PFEII의 N-terminal 소수성 도메인부분과 PFEI을 결합한 퓨전단백질은 ester 3에 대한 가수분해 활성을 6배 가량 증가시켰다 (i.e., ca. 6-folds increase in the kcat value). 이러한 결과는 PFEII의 N-terminal 소수성 도메인부분이 세포질막의 고정에 관여하는 것으로 보여지고, 이것이 지방산과 상호작용하여 효소의 활성을 증가시키는 것으로 보여진다. 그러므로 기질 결합 도메인을 도입함으로써, 지방산 전환효소의 촉매활성을 높이는 데 기여할 수 있을 것이라 사료된다.