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Pathophenotypes of DJ-1 Protein-Deficient Dopaminergic Neurons

Title
Pathophenotypes of DJ-1 Protein-Deficient Dopaminergic Neurons
Authors
심정희
Issue Date
2013
Department/Major
대학원 뇌·인지과학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Doctor
Advisors
손형진
Abstract
Mutations in the DJ-1 gene (PARK7) cause an autosomal recessive form of early-onset familial Parkinson’s disease (PD). DJ-1 has been speculated to function as a multifunctional protein with anti-oxidant, chaperone, protease, mitochondrial regulator and transcriptional modulator activity. However, both precise physiological functions of DJ-1 protein in DA neurons and pathophenotypes of DJ-1-deficient DA neurons have not yet been fully characterized, partly due to lack of a faithful DA neuronal model for DJ-1 deficiency. Consequently, no therapeutic target to alleviate DA neuronal loss for PD patients carrying DJ-1 mutations is known. In this study, the full pathophenotype of the DJ-1-deficient DA neurons was characterized and the theoretical basis for novel therapeutic targets for DJ-1-deficient PD patients was speculated. To overcome the technical challenges of assessing the pathophenotypes in DA neurons from familial PD cases, homogeneous DA cells from DJ-1-deficient mouse embryos were harvested at E13.5 days and stable cells were established. The established cells were used to investigate the biochemical nature of various pathological mechanisms and to identify novel therapeutic targets. After establishing DJ-1-deficient DA neuronal cells, I first investigated whether DJ-1 deficiency increased oxidative stress (OS). As expected, intracellular accumulation of ROS was apparent in DJ-1-deficient neurons. Since the major source of increased ROS production is defective mitochondria, it was investigated whether any gross mitochondrial structural defects were present. DJ-1 deficiency resulted in the accumulation of defective mitochondria, accompanied by the moderate decreases (20-30%) in complex I and II activity. Based on the increased OS, it was shown that Trolox dramatically improved complex I enzyme activity in the DJ-1-deficient cells. Taken together, these data suggest that DJ-1-deficiency may cause more severe mitochondrial damages in DA neurons than non-DA cells and antioxidant therapy may improve mitochondrial dysfunction in familial PD by promoting recovery from oxidative damage within complex I subunits. DJ-1-deficient DA neuron model also revealed an accumulation of damaged mitochondria and defective mitophagy, suggesting that DJ-1 may play another essential role for the turnover of damaged mitochondria and that the failure to induce mitophagy may underlie the selective DA neuronal loss observed in PD patents carrying DJ-1 mutations. Thus, further elucidation of DJ-1’s role in mitophagy may reveal novel therapeutic target to slow disease progression in PD. It was demonstrated that autophagosome content and autophagic flux were significantly enhanced by DJ-1 deficiency, indicating that a DJ-1 deficiency may result in increased synthesis of autophagosomes and impaired basal autophagic flux. The present data suggest that pathogenic autophagy associated with DA neuronal death does occur in DJ-1-deficient condition and may be distinct from basal neuronal autophagy. Further identification of autophagy induction and autophagic cell death mechanisms in DJ-1-deficient DA neurons may lead to novel therapeutics that help restore homeostasis to DA neurons in PD. Gene Chip analysis revealed that the expression of genes related to oxidoreductase, cell structure and motility and signal transduction was greatly increased. Interestingly, the expressions of familial PD genes were significantly increased by DJ-1 deficiency and neuronal susceptibility of DJ-1 K.O. cells to OS was dramatically enhanced by additional loss of PINK1 or parkin, suggesting enhanced functional cross-talk with other familial PD genes. Especially, the functional correlation between increased Hsp25 and altered autophagy was identified in DJ-1 K.O. DA neurons. Specifically, microarray analysis revealed the very significant expression of chaperone Hsp25 by the DJ-1 deficiency. Autophagy was dramatically increased in DJ-1-deficient DA neurons, while Hsp25 levels were increased only by autophagy inducing conditions, such HS and rapamycin. Hsp25 K.D. also inhibited the induction of autophagy and the inhibition of autophagy by 3-MA accelerated the neuronal death under OS. Therefore, our data suggest that DJ-1-deficient pathological conditions are similar to the conditions induced by HS (i.e. increased accumulation of misfolded proteins and their aggregates) and rapamycin (i.e. induction of autophagy). Thus, enhanced autophagy could be a useful therapeutic strategy in DJ-1-deficeint PD patients. In conclusion, I have established DJ-1-deficient DA neuron model to assess precise pathophenotypes of DJ-1-deficient DA neurons to establish novel therapeutic targets in degenerating DA neurons in familial PD. Biochemical analyses of the current model revealed the simultaneous presence of multiple pathological phenotypes in DJ-1-deficient DA neurons, such as increased OS, severe mitochondrial damages and ETC complex I and II deficits, defective mitophagy and dysfunctional autophagy, suggesting the necessity of combinatorial therapeutic strategy for PD patients carrying DJ-1 deficiency.;파킨슨병은 중뇌 흑색질에 위치한 도파민성 신경세포의 사멸로 인해 발생하는 퇴행성 신경 질환이다. 그 발병 원인으로는 유전적 요인들과 다양한 환경적 요인들이 있다. 특히, 원인 유전자들 중 상염색체 열성 유전자인 DJ-1은 세포 내에서 항산화성 샤페론의 기능을 통해 세포를 사멸로부터 보호하고 또한 미토콘드리아의 전자 전달계를 조절하여 세포의 항상성을 유지시키는 것으로 추정되고 있다. 그러나 현재까지 도파민성 신경에서의 기능은 명확히 보고되어 있지 않으며, 본인은 도파민성 신경 내에서 DJ-1 단백질의 생리학적 역할과 DJ-1 결핍으로 야기되는 도파민성 신경 내 병리학적 현상을 알아보고자 DJ-1 기능 결핍 도파민성 신경 세포주를 수립하였다. 수립한 DJ-1 유전자 기능 결핍 도파민성 신경은 첫째, 세포 내 활성 산소의 발생으로 인해 산화적 스트레스가 증가하였으며 이로 인해 미토콘드리아 내 크리스테 및 이중막의 손상과 제 1 전자 전달계의 심각한 활성 감소가 관찰되었다. 이러한 기능 감소는 항산화 물질인 Trolox에 의해 회복되어지므로 이는 DJ-1 기능 결핍에 따른 미토콘드리아의 기능 손상은 세포 내에 증가한 활성 산소에 기인함을 확인하였다. 또한 손상 된 미토콘드리아는 미토파지에 의해 분해되어 항상성을 유지하지만 DJ-1 기능 결핍 도파민성 세포는 이러한 미토파지의 기능이 손상되어 결국에는 신경 세포 내 손상된 미토콘드리아 축적과 산화 스트레스 생성에 기여함을 확인하였다. 둘째 DJ-1이 샤페론 활성을 가지고 있음을 확인하였고 또한 도파민 신경 내 DJ-1 의 결핍으로 인해 오토파지가 증가하는 것을 관찰하였다. 이를 통해서 DJ-1의 결핍에 따른 세포 내 비정상적인 단백질 응집체들의 생성으로 인해 오토파지가 증가하는 것을 확인하였다. 마지막으로 DJ-1 기능 결핍에 의한 분자유전학적 변화를 분석하기 위하여 이전에 수립되어진 SN4741 도파민성 신경 세포를 대조군으로 하여 DNA칩 분석을 실행 한 결과 파킨슨병 관련 유전자들의 증가와 미토콘드리아의 활성 관련 그리고 세포 사멸과 관련된 유전자들이 크게 변화하였다. 특히, Hsp25 샤페론 유전자가 크게 증가하였으며 이는 단백질 수준에서도 확인되어 졌다. 이러한 Hsp25의 발현 증가는 DJ-1 유전자 결핍 뿐만 아니라 열충격과 오토파지 유발 조건에서도 동일하게 증가하여 DJ-1 결핍으로 유도된 병리학적 상태는 열충격 혹은 라파마이신으로 유도되는 잘못 결합 된 단백질 축적 및 오토파지 장애 상태와 유사함을 시사하였다. 결과적으로 현재까지 도파민성 신경에서의DJ-1 의 정확한 기능이 밝혀지지 않았기 때문에 DJ-1 기능 이상으로 발병된 파킨슨병 환자의 구체적인 치료법이 제시되지 못 하였다. 그러나 해당 논문에서 사용 되어진 DJ-1 기능 결핍 도파민성 신경 세포의 형질 분석 결과 DJ-1이상으로 인해 발병된 파킨슨 환자의 미토콘드리아 전자 전달계, 특히 제 1 전자 전달계의 활성을 증가시키고 미토파지의 정상적인 기능 수행을 통해 손상된 미토콘드리아의 분해가 원활히 이루어지도록 하는데에 초점을 맞추는 것이 중요하겠다. 그리고 샤페론 활성 향상과 오토파지의 유도를 통해 이상 단백질의 분해를 촉진시키고 이러한 과정에서 Hsp25의 보상적 활성 조절 등이 고려 된 상호 복합적인 여러 타켓들을 고려하여 새로운 복합 치료의 길을 제시할 수 있을 것이다.
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일반대학원 > 뇌·인지과학과 > Theses_Ph.D
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