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Resurfacing a DNA binding protein

Title
Resurfacing a DNA binding protein
Authors
이보라
Issue Date
2013
Department/Major
대학원 생명·약학부생명과학전공
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Advisors
심현보
Abstract
Phage display 기법에서 단백질이나 펩타이드들은 박테리오파아지의 표면에 노출되게 되며, 이를 통해 표적 항원에 특이적으로 결합하는 단백질이나 펩타이드들을 빠른 시간 내에 증폭시키고, 그를 검증하는 것이 가능하다. 징크 핑거 단백질은 전형적으로 핵산과 결합하는 모티프로써, 우리는 Zif268 징크 핑거 도메인에서부터 비롯된 단백질 라이브러리를 제작하였다. 그 결과 만들어진 ZiFi 라이브러리는 M13 박테리오파아지의 표면에 노출되게 된다. 이 논문에서는 세 개의 비핵산 항원들을 선택하여 라이브러리의 검증에 이용하였으며, 그 중에서도 특히 작은 형광 유기분자로서 다양한 범위에 걸쳐 사용되는 Fluoresceinisothiocyanate(FITC)를 운반체 단백질 중 하나인 BSA에 결합시킴으로써 만들어진 FITC-BSA를 모델 항원으로 하여, ZiFi 라이브러리를 바탕으로 표적항원에 특이적인 클론들을 선별하고 그를 검증하는 실험을 진행하였다. 비핵산 항원들을 이용하여 4차까지의 패닝을 실시하였으며, 그 중에 서도 FITC-BSA 항원을 이용한 3차 패닝 결과로부터 phage ELISA 기법을 이용해 65개의 항원특이적인 클론들을 선별해 낼 수 있었다. 시퀀싱 결과, 패닝 결과물들의 다양성이 상당히 높았으며, 클론마다 고유한 성격을 가지고 있다는 것을 확인 할 수 있었다. 그 중에서도 우리는 특별히 D8 클론을 선택하였으며, 이것의 결합력을 측정하기 위해 경쟁 ELISA, 표면 플라즈몬 공명 분석, 동물세포로의 형질주입, 분광색차계를 이용한 구조분석뿐만 아니라 돌연변이 연구 등의 다양한 실험들을 진행하였다. 그 결과 이렇게 선별된 징크 핑거 단백질들은 안정한 형태로서 높은 친화력과 결합능력을 가지는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 이런 징크 핑거 모티프 단백질은 항원 특이적인 클론들의 선별에 있어 기존 항원의 형태와는 조금 다르지만, 그를 대체 할 수 있는 실현 가능한 대안으로 사용할 수 있을 것으로 생각된다. 뿐만 아니라, 우리가 제작한 ZiFi 라이브러리를 바탕으로 phage display 기법을 이용하여 만들어진 항체는 치료용 항체의 개발뿐만 아니라 넓은 범위의 생물학적 연구에 유용하게 쓰일 수 있을 것이다.;Zinc finger is a prototypical DNA-binding protein motif. By randomizing the DNA-binding residues, a protein library derived from Zif268 zinc finger domain had been previously constructed in this laboratory. The resulting library (ZiFi library) can be displayed on M13 filamentous bacteriophages and screened for isolation of binders against non-nucleic acid targets. In this study, three of non-nucleic acid antigens (FITC-BSA, AIMP3, LRS) were chosen for the characterization of the library. Especially, FITC, small fluorescent organic molecule, used in wide-ranging applications conjugated to a carrier protein (FITC-BSA) was focused as a model antigen to isolate target-specific binders from ZiFi library. Four rounds of panning with immobilized non-nucleic acid antigens were performed and in case of FITC-BSA antigen, 65 clones were identified by phage ELISA. The sequencing data showed that the panning output was highly diverse and every sequenced clone was unique. We selected a specific clone, D8, and characterized its binding activity by competition ELISA, surface plasmon resonance and circular dichroism analysis, as well as by mutation studies. Our results show that through the diversification of DNA-binding residues of Zif268, engineered zinc finger proteins with a binding specificity against non-nucleic acid target molecules can be obtained.
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