Development and Characterization of Aptamers against PAUF and IL-8

Abstract

Aptamers are single-chain nucleic acids that fold into unique 3D structures, which bind specifically to multiple different targets with high binding affinity and specificity. Aptamers are often compared with antibodies because of their characteristics of specific binding to targets and their wide range of applications. Several properties (e.g., high thermostability, easy accessibility to targets, easy modification, no immunogenicity, and no toxicity) make aptamers attractive therapeutic agents. PART I of this thesis covered a study on the development and characterization of aptamer against PAUF. Previously, Kim et al. reported that a novel secretory protein, PAUF (pancreatic adenocarcinoma up-regulated factor), which is highly expressed in pancreatic cancer and mediates the growth and metastasis of pancreatic cancer cells. In this study, a 2′-fluoropyrimidine modified RNA aptamer (P12FR2) directed against human PAUF was generated and characterized. P12FR2 binds specifically to human PAUF with an estimated apparent KD of 77 nM. P12FR2 aptamer inhibits PAUF-induced migration of PANC-1, human pancreatic cancer cells, in a wound healing assay. Moreover, intraperitoneal injection of P12FR2 decreased tumor growth by about 60% in an in vivo xenograft model with CFPAC-1 pancreatic cancer cells, without causing a loss of weight in the treated mice. Taken together, I propose here that PAUF-specific RNA aptamer, P12FR2, has the potential to be effective in the therapy of human pancreatic cancer. A study on the development and characterization of aptamers against interleukin-8 was covered in PART II. Interleukin-8 (IL-8), a potent chemoattractant for neutrophils, is known to have an impact on tumorigenesis, metastasis, and angiogenesis in various cancers. In the present study, RNA aptamers modified with 2―fluoropyrimidine (named 8A-44, 8A-35, and 8A-30) against human IL-8 were developed and characterized. The 8A-44, 8A-35, and 8A-30 aptamers bind to IL-8 with high specificities and high affinities, with KD values of 5.15 nM, 46.3 pM, and 13.5 nM, respectively. These aptamers inhibit IL-8-induced migration, extracellular signal-regulated kinase (ERK) and Akt phosphorylation, and intracellular Ca2+ mobilization in neutrophils, as well as invasion of oral cancer cells induced by cancer cell-derived IL-8. In particular, 8A-35 has the lowest kd value among these aptamers. In conclusion, I suggest that 8A-35 aptamer has great potential for use as a lead structure in the development of effective anticancer therapeutic agents.;압타머는 그 자체로 특유의 3차 구조를 이루어 다양한 종류의 표적분자에 대해 높은 친화력과 특이성을 가지고 결합할 수 있는 특징을 지닌 단일 가닥의 핵산이다. 표적분자에 특이적으로 결합할 수 있다는 특징과 함께 넓은 범위에의 응용이 가능하다는 점에서 압타머는 항체와 자주 비교가 된다. 압타머의 몇 가지 특성 (즉, 높은 열안정성, 타겟에 대한 용이한 접근성, 변형의 용이성, 면역원성과 독성이 없다는 점) 들은 압타머의 치료제로서의 높은 가능성을 말해준다. 본 논문의 첫 번째 부분에서는 PAUF에 대한 압타머의 발굴과 그 특성 분석에 관한 연구 결과를 다루고 있다. PAUF는 췌장암에서 그 발현이 높게 나타나는 성장인자로서 췌장암 세포의 성장과 전이를 매개하는 것으로 알려져 있다. 본 연구를 통하여, PAUF에 특이적으로 결합하는 RNA 압타머 (P12FR2)를 발굴하여 그 특성을 조사하였다. P12FR2는 77 nM의 높은 결합력을 가지고 PAUF에 특이적으로 결합할 뿐만 아니라, PAUF에 의해 유도되는 췌장암 세포 (PANC-1)의 이동을 저해한다는 것을 규명하였다. 뿐만 아니라, 췌장암 세포 (CFPAC-1)을 이용한 동물 모델에서도 P12FR2가 종양의 성장을 약 60% 정도 감소 시킨다는 것을 규명하였다. 위의 결과들로부터, PAUF 특이적인 P12FR2 압타머의 췌장암 치료제로서의 가능성을 기대해 볼 수 있다. 본 논문의 두 번째 부분에서는 interleukin-8 (IL-8)에 대한 압타머의 발굴과 그 특성 분석에 관한 연구 결과를 다루고 있다. IL-8은 호중성 백혈구 (neutrophil)에 대해 강력한 화학유인물질로 작용할 뿐만 아니라, 다양한 암에서 종양발생, 전이, 그리고 혈관형성에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 본 연구는 IL-8에 대한 세 종류의 RNA 압타머 (8A-44, 8A-35, 8A-30)를 발굴하였고 그 특성을 조사하였다. 8A-44, 8A-35, 그리고 8A-30 압타머는 IL-8에 대해 높은 결합력과 특이성을 보이며, 각각의 KD값은 5.15 nM, 46.3 pM, 13.5 nM로 측정되었다. 이 압타머들은 IL-8에 의해 유도되는 neutrophil의 이동, 세포 내 ERK와 Akt 의 인산화, 세포 내 칼슘의 증가를 저해할 뿐만 아니라, 구강암세포에서 분비되는 IL-8에 의해 유도되는 구강암 세포의 침윤을 저해한다는 것을 규명하였다. 특히, 8A-35 압타머는 이들 압타머 중에서 가장 낮은 kd 값을 가지는 것으로 밝혀져, 효과적인 항암제 개발에 있어서 선도 물질로서의 높은 사용 가능성을 기대해 볼 수 있다.