Evidence-Based Guidelines for Designing Human Intervention Trials to Evaluate the Effects of a Food or Its Constituents on the Liver

Abstract

본 연구에서는 식품의 간건강 개선효과를 평가하는데 핵심이 되는 인체중재시험을 설계하기 위해 필요한 요소들에 대해 근거 중심의 가이드라인을 제시하고자 하였다. 이를 위해 식품과 간건강의 상관관계를 연구한 인체중재시험을 Pubmed와 KISS에서 문헌검색하였으며, 확인된 자료 2,610건 중 자료의 적합성 기준에 부합되는 52건의 연구를 인체 설계에 필요한 7개 핵심 요소 및 41개 항목에 따라 자료를 추출하여 데이터베이스화 하였다. 또한 구축된 데이터베이스를 통합분석하여 지방간(fatty liver), 간염(mild to moderate hepatitis), 발암 스트레스(carcinogenic stress) 개선효과 확인을 위한 인체연구 설계에 필요한 가이드라인을 도출하였다. 첫번째로, 영양과잉으로 인한 지방간(overnutrition-induced fatty liver)은 인슐린 저항성 또는 비만과 상관성이 높기 때문에 지방간 개선효과와 함께 인슐린 저항성 또는 비만과 관련된 바이오마커의 변화를 확인할 필요가 있다. 또한 지방간 발생에 대한 세부 기전 확인을 위해서는 지방조직 등에서의 지방분해(peripheral lipolysis), 지방 생합성 (de novo lipogenesis), 지방 산화 (fat oxidation)와 관련된 마커를 측정하는 것이 도움이 된다. 지방간이 있는 피험자 모집을 위해 아미노산전이효소(aminotransferase) 수준과 함께 지방간 여부를 확인한 연구들이 상당수였다. 지방간 여부 확인은 초음파(ultrasonography), CT (computed tomography), MRS (Magnetic resonance spectroscopy) 등의 방법을 활용할 수 있으며 각각의 방법에 대해 장단점을 파악하여 연구목적에 따라 선택할 필요가 있다. 알코올로 인한 지방간을 배제하기 위해 피험자들의 알코올 섭취량을 20~40 g/day (소주잔으로 약 3 ~ 5잔에 해당)로 제한하는 경우가 많았다. 연구기간은 대부분 12 ~ 24주로 시험식품의 작용 기전 및 바이오마커 종류에 따라 달라질 수 있으나 지방간 개선효과 확인을 위해서는 적어도 12주 이상 중재기간이 필요할 것으로 판단된다. 영양과잉으로 인한 지방간은 체중조절만으로도 개선효과가 나타날 수 있으므로 중재기간 중에 시험식품 섭취와 함께 식이와 활동량 조절을 통해 체중조절을 병행하는 것도 좋은 방법일 수 있다. 실제로 다수의 식품중재시험에서 시험기간 중 저열량 식사나 운동처방을 통해 체중조절을 병행한 후 개선효과를 확인하였다. 알코올로 인한 지방간 또는 간염은 급성 또는 만성적 알코올 산화과정으로 인해 유발된다는 점에서 영양과잉으로 인한 간손상과 발병기전에서 차이를 보인다. 따라서 흡수된 알코올과 아세트알데히드(acetaldehyde)의 효율적인 제거가 중요하다고 할 수 있다. 몇몇 연구들에서 건강한 성인에게 알코올과 함께 시험식품을 섭취시켰을 때 알코올과 아세트알데히드가 효과적으로 제거되는 것으로 보고되고 있다. 알코올로 인한 간손상 개선효과를 확인하기 위해서는 목표 피험자의 선택이 중요한데, 피험자들의 알코올 섭취량 기준을 정하는 것이 관건이라 할 수 있다. 경도에서 중등도 정도에 해당되는 알코올 섭취량에 대한 국제적으로 합의된 기준은 없으나 여러 연구들에서 알코올로서 약 10 ~ 60 g/day (소주로서 9잔 이하) 정도가 제안되고 있다. 또한 알코올 대사에 대한 남녀 차이(gender-effect)도 함께 고려할 필요가 있겠다. 최근 여려 연구들에서 알코올로 인한 지방간 또는 간염의 개선효과 확인을 위해 GGT (gamma glutamyl transferase), paraoxonase, TNF-α, apolipoprotein A1/B, the mean corpuscular volume of erythrocytes, isoprostane, vascular endothelial growth factor 등의 바이오마커가 제안되고 있다. 과잉영양으로 인한 지방간염(overnutrition-induced steatohepatitis)은 만성적 산화스트레스 및 염증반응과 관련이 있다. 따라서 인체연구에서는 이들과 관련된 바이오마커가 널리 활용되고 있으며, 최근에는 thioredoxin, ferritin, adiponectin, hsCRP, caspase cleaved CK18, isoprostanes, endotoxin 관련 마커들이 함께 측정되고 있다. 간염이 있는 피험자를 선별하기 위해 혈중 caspase cleaved CK-18, adniponectin, resistin의 수준을 활용하는 등 비침습적(non-invasive) 방법들이 제안되고 있다. 시험기간은 대부분 20 ~ 24주 후 중재효과를 확인하였다. 중재 기간 중 식이 및 생활습관 조절 방법은 영양과잉으로 인한 지방간 연구와 유사하였다. 마지막으로 발암 스트레스는 간의 해독작용에 관여하는 phase I, phase II enzymes을 활성 또는 억제시킴으로써 완화시킬 수 있다. 따라서 식품을 통한 중재시험에서는 cytochrome P450 eyzmes (CYP`1A2, 2A6, 3A4, 2D6, 2C9, 2E1 등)와 같은 pahse I enzymes, glutathione-S transferase (GST-α, -μ, -π, hGSTP1 등)과 같은 phase II enzymes의 활성을 측정하는 것이 유용하다. 대부분의 연구에서는 흡연하지 않는 건강한 성인을 대상으로 이들 효소들의 활성화 여부를 확인하였으며, 일부 연구들에서는 잘 알려진 식품 유래 발암성분을 공급(탄고기를 섭취시키는 등)하여 이들 성분의 대사 속도 등을 확인하였다. 해독작용에 대한 성별차이에 대해서는 아직 논란이 있으므로 피험자를 특정 성별로 제한하는 문제는 충분히 고려할 필요가 있다. 해독작용 개선효과는 12 ~ 14일의 단기간에도 확인 가능한 것으로 보고되고 있다. 또한 식이와 활동량 수준은 효소 활성에 영향을 줄 수 있는 중요한 요인이므로 중재기간 중에 식이와 활동량을 면밀히 조절하는 것이 중요하다고 할 수 있다. 본 연구에서 지방간, 간염, 발암 스트레스에 대해 제시한 근거중심의 가이드라인은 향후 실제 연구 설계시 피험자 선정∙제외 기준, 바이오마커, 시험기간 및 식이∙생활습관 조절 방법 등을 결정하는데 있어 근거 자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 다만, 제안된 내용들은 개별 연구의 목적에 부합되도록 가감하여 활용할 필요가 있으며, 실효성과 설용성이 함께 추가 검토되어야 하겠다. 또한 본 연구에서는 간에 대한 식품의 중재범위를 체내 항상성 조절로 제한하여 비가역적인 병리상태, 예를 들어 간부전이나 간암은 식품의 중재영역에서 제외시켰으나 이들 질병이 있는 환자들의 삶의 질을 개선시킨다는 측면에서 약물의 보조적 수단으로서 식품의 활용방안을 검토하는 것도 의미있는 일이라 할 수 있겠다. 또한 본 연구결과를 바탕으로 간에 도움이 될 수 있는 유망 식품소재를 발굴하고, 다양한 항상성 도전모델(chanllenge model)을 개발하는 것도 향후 필요한 연구분야라 할 수 있겠다.;This study was performed to provide evidence-based guidelines for designing human intervention trials to evaluate the effects of a food or its constituents on the liver.First of all, human intervention trial database related to a ‘food and liver health relationship’ was constructed based on a comprehensive literature search. A total of 2,610 human articles were identified through Pubmed, KISS, and other resources published from April, 2007 to October, 2012. Of these, 52 articles were included according to the eligibility criteria for data selection. Eligible articles related to fatty liver, hepatitis, and carcinogenic stress were 28, 15, and 14, respectively. These data were compiled according to 7 key factors and 41 items related to the crucial considerations for designing human intervention trials. Based on combined analysis of the database, four types of evidence-based guidelineswere produced. The first, overnutrition-induced fatty liver could be target of nutritional intervention. It includes excessive dietary overload combined with insulin resistance and/or obesity. Insulin resistnace-mediated abnormalitiesin peripheral lipolysis, fat oxidation, and de novo lipogenesis were keypathological mechanisms. Thus, biomarkers related to the pathogenesis should be examined for identifying health effects of foods on overnutrition-induced fatty liver. Of related biomarkers, tissue type plasminogen activator inhibitor-1, β-hydroxybutyrate, and bile acidshave been proposed as promising markers. In most of food-based intervention studies, abnormal aminotransferases activity and radiographical or histological toolssuch as ultrasonography, CT, MRS, and liver biopsy were used for selection of relevant subjects with fatty liver. In addition, alcohol intake level was limited to less than 20 to 30 g /day (about 3 to 5 glasses of soju). Individuals with viral, autoimmune, alcoholic, and hereditary liver disease were excluded. In order to evaluate changes of hepatic fat contents, a long term period, about 12 to 24 weeks, was required. Finally, volunteers can be recommended to reduce calorie intake and increase physical activity in order to improve insulin resistance and obesity. Secondly, alcohol-induced fatty liver or hepatitis is caused from metabolic abnormalities induced by an alcohol oxidation pathway. Thus, it is important to eliminate ingested alcohol and its intermediate metabolite acetaldehyde. In challenge model, blood alcohol and acetaldehyde were reduced after alcohol consumption with supplementation of test foods. In the case of alcoholic fatty liver or hepatitis, it is necessary to consider the gender-specific effect on alcohol metabolism because women have a well-documented risk factor for susceptibility to alcoholic liver disease. Indeed, there are many studies in which only men were included for evaluation of health effects related to alcoholic liver health problems. In addition, the key is to determine the criteria for alcohol intake level in order to select relevant target subjects. Even though there is no unitary accepted definition of mild to moderate drinking, about 10 to 60 g/day of alcohol has been suggested. Gamma glutamyl transferase, paraoxonase, TNF-α, apolipoprotein A1/B, the mean corpuscular volume of erythrocytes, isoprostane, vascular endothelial growth factor, and markers related to endotoxin-mediated hepatic liver damage were proposed as promising biomarkers. The third, overnutrition-induced hepatitis is closely related to chronic oxidative stress and proinflammatory response as an aspect of pathological mechanisms. Thus biomarkers related to reduction of oxidative stress and proinflammation can be examined in human study. Recently, thioredoxin, ferritin, adiponectin, hsCRP, caspase-cleaved CK 18, ox-LDL, lipidperoxide, isoprostanes, and markers related to endotoxin-mediated liver damage were measured in related human studies. Eligibility criteria for participants and method of diet/lifestyle control were similar to that of studies examinedfor improvement of overnutrition-induced fatty liver. In order to find non-invasive tools for screening subjects with hepatitis, various methods have been proposed. A novel diagnostic biomarker panel including caspase cleaved CK-18, serum adiponectin, and serum resistin for obesity-related nonalcoholicsteatohepatitis was suggested. The most frequent test duration was 20 to 24 weeks. The fourth, carcinogenic stress can be reduced by induction of detoxifying enzymes. Thus, phase I enzymes such as cytochrome P 450 enzymes (CYP1A2, 2A6, 3A4, 2D6, 2C9, 2E1) and phase II enzymes such as glutathione-S transferases (GST-α,-μ, -π, hGSTP1) can be evaluated for identification of health effects on detoxification. In a majority of human studies, healthy non-smokers were selected as target subjects. Gender-related differences of detoxification metabolism were still controversial. In a few studies, participants were equal number of men and women were recruited in order to minimize confounders from gender. Test duration was less than 1 month in all of eligible studies. Fifty seven percent of studies were performed during 12 to 14 days. Because diet andphysical activity was the crucial effectors of the enzyme activities, diet and lifestyle should be carefully controlled duringa run-in and intervention period. In conclusion, combined analysis of a human intervention trial database resulted in evidence-based recommendations and guidance for designing human intervention trials to evaluate beneficial effects of a food or its constituents on three categories of liver health problems, i.e. fatty liver, mild to moderate hepatitis, and carcinogenic stress. These guidelines will provide a basis for determination of key elements such as eligibility criteria for participants, biomarkers, test duration, and diet/lifestyle control although further discussions may be necessary in order to elaborate upon a practical methodology for process of human intervention trials.