Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1∆E9 transgenic mouse models of Alzheimer disease

Abstract

Alzheimer’s disease(AD) is the most common form of neurodegenerative disease. The neuropathological hallmarks of AD include the accumulation of neuritic plaques composed mainly of extracellular Aβ peptides, neurofibrillary tangles containing hyperphosphorylated tau proteins, and selective neuronal loss in the brain. To investigate the detailed mechanism of the pathogenesis of AD, many scientist have attempted to generate AD murine models that recapitulate the neuropathology of AD in the past decades. Proper animal models of AD provide also the predictive value that leads to unravel a novel mechanism in AD and to new directions for therapy. Many of animal models of AD developed with such hope mimic plaque deposition, a core pathological marker of AD brains. Immunohistological and ELISA analyses of Aβ deposition in the brain of AD animal models have been routine in working with plaque deposition models. Adequate assessment of plaque deposition levels in the brain of mouse models of AD is required in many core issues of studies on AD, identification of cellular factors modifying plaque pathology, and developments of anti-AD drugs. The present study was undertaken to quantitatively evaluate plaque deposition patterns in the brains of the two popular AD models, Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 mice. These two AD models express the transgenes that harbor human mutant APP or PS1, and have been proved to express plaque depositions in the brain. Tg2576 mice have been one of most popular AD models because of easy availability (from Taconic Inc) and obvious phenotypes including plaque depositions and behavioral deficits. Tg-APPswe/PS1dE9 mice also easily available from JAX and Aβ plaque deposition started at earlier age, 6.5 months. Coronally-cut brain sections of the transgenic mice were prepared and plaque depositions were visualized by staining with anti-Aβ antibody. Microscopic images of plaque depositions in the prefrontal cortex, parietal cortex, piriform cortex and hippocampus were obtained and the number of plaques in each region was determined by a computer-aid image analysis method. In the course of applying computer-aid image analysis method, the number of plaques in a defined rectangular area was found to be varied depending on the cut-off value of pixel size and staining intensity of plaques. Therefore, a valid condition was needed for detailed analysis of optical images. A systematic comparison of small size plaques on the microscopic field and plaque images produced by a computer program led me to convince that plaques labeled by 3 pixels and higher in digital images are reliable, whereas captured images labeled by 1 or 2 pixels were found to be often false. Using a computer-aid image analysis method along with a firmed criteria described above, a series of optical images representing a gradual increase of plaque deposition levels in the brains of Tg2576 mice were selected in the four different brain regions and were assigned in each with a numerical grade of 1-6, where +1 was lowest and +6, highest, so that plaques per unit in mm2 increased “sigmoidally” over the grading scales. It was chosen that the levels of plaque deposition of brain sections had the logarithmic relationship between the photographic plaque reference panels and number of plaques determined by a computer-aid image analysis method. The 6-grade photographic plaque reference method established has the feature to analyze the levels with low numbers in more detail than those with high numbers because logarithmic values of plaque numbers at low levels were given with more scales than logarithmic values of plaque numbers at high levels. A similar work was performed fo Tg-APPswe/PS1dE9 mice. Next, anti-Aβ stained brain sections of the two AD models at various ages were prepared and plaque deposition levels were assessed using the 6-grade photographic plaque reference panels and independently by a computer-aid image analysis method. By analyzing plaque depositions using the 6-grade photographic plaque reference panels and a computer-aid image analysis method, it was demonstrated that the brains of Tg2576 mice started to accumulate predominantly small plaques, while the brains of Tg-APPswe/PS1dE9 mice deposited relatively large plaques. The present study demonstrated further the usefulness of the 6-grade photographic plaque reference method in measuring plaque levels. Considering that existing plaque counting systems including a typical computer-aid analysis method take a long time, pains and a tedious work, the 6-grade photographic plaque reference method has an advantage to make plaque evaluation easily and quickly. ;알츠하이머병은 가장 흔한 퇴행성 뇌질환으로 신경병리학적으로 아밀로이드 펩타이드로 이루어진 노인반과 과인산화된 타우 단백질로 이루어진 신경섬유매듭의 축적, 뇌의 전반적인 위축, 선택적인 신경세포들의 손실 등의 특징을 나타낸다. 알츠하이머병의 발병 과정 및 원인 연구를 위해서 지난 수 십 년간 알츠하이머병의 신경병리학적 특징을 갖는 다양한 종류의 동물 모델의 개발이 시도되었다. 이러한 알츠하이머병 동물 모델들은 알츠하이머병의 발병 과정을 밝히는 데 유용할 뿐 아니라 새로운 치료제, 치료법 개발에 대한 연구 방향을 제시할 것으로 기대된다. 대부분의 알츠하이머병 동물 모델은 알츠하이머병 환자의 뇌에서 나타나는 핵심 특징인 노인반의 축적이 유사하게 나타나도록 개발되었다. 알츠하이머병 모델 동물의 뇌조직에 축적되는 아밀로이드 베타를 면역조직화학적 방법으로 정확하게 측정하는 것은 모델 동물을 이용한 알츠하이머병 연구에 있어서 매우 기본적이고 필수적인 과정이다. 본 연구에서는 알츠하이머병 연구에 가장 많이 사용되는 두 종류의 동물 모델, 즉 Tg2576과 Tg-APPswe/PS1dE9 마우스의 뇌조직에서 나타나는 노인반 축적을 정량적으로 비교 분석하고자 하였다. 이 두 종류의 알츠하이머병 모델 마우스는 인간의 APP 또는 PS1의 돌연변이 유전자가 뇌조직에 발현되도록 제작된 유전자이식 동물로서 어느 정도의 노화가 진행되면 이들 모델 마우스의 뇌에는 노인반 축적이 일어난다. Tg2576 마우스는 구하기 쉽고, 노인반의 축적과 행동적 결함 등의 표현형이 뚜렷하기 때문에 가장 많이 이용되는 알츠하이머병 동물 모델이다. Tg-APPswe/PS1dE9 마우스도 마찬가지로 접근이 용이하고 비교적 이른 시기인 6.5개월경부터 노인반 축적이 나타나는 특징을 갖는다. Tg2576과 Tg-APPswe/PS1dE9 마우스의 뇌에서 노인반의 축적을 관찰하기 위해 관상면으로 자른 뇌조직을 아밀로이드 베타 항체로 염색하였다. 두 모델 마우스 뇌조직의 전전두엽 피질 (prefrontal cortex), 두정엽피질 (parietal cortex), 조롱박피질 (piriform cortex) 및 해마 (hippocampus) 지역의 현미경적 영상을 디지털 카메라로 찍은 후 각 지역마다 일정한 크기의 직사각형 내에 존재하는 노인반의 축적 정도를 컴퓨터 프로그램을 통해 분석하였다. 컴퓨터 프로그램 방법에 기초한 이미지 분석 방법은 뇌 조직의 염색 강도, 영상 촬영시의 조도 또는 디지털화시의 픽셀 크기의 컷오프 설정 등에 따라서 단위 면적당 축적된 노인반의 수가 달라지는 특성이 있었다. 특히 서로 다른 시기에 준비된 두 종류의 뇌조직에 대해 노인반의 축적 정도를 정확하게 비교 분석하기 위해서는 매우 엄격하면서도 적절한 작업이 필요하였다. 컴퓨터 기반 이미지 분석 프로그램으로 식별할 수 있는 노인반을 현미경으로 관찰되는 현미경상에서 관찰되는 실제 영상과 비교하여 조사한 결과 디지털 이미지에서 1-2 픽셀로 읽히는 이미지는 노인반 처럼 보이지만 실제 노인반이 아닌 경우가 대부분 이었기 때문에 컴퓨터 프로그램을 이용하여 노인반 수를 분석할 경우 디지털 이미지 상에서 3 픽셀 이상의 크기로 표지되는 것을 대상으로 실제 분석에 적용하였다. Tg2576 마우스의 뇌조직에 다양한 노인반의 축적 정도를 보이는 이미지를 선택하여 노인반의 수가 점차적으로 증가하는 방향으로 이미지를 배열하였다. 각각 4 지역의 이미지를 선택하여 1-6 단계로 나누어 1 단계에서 6 단계로 갈수록 노인반 축적 정도가 시그모이드형 성장 곡선을 나타내도록 설정하였다. 각 뇌지역의 노인반 분포 정도는 6-등급 노인반 이미지 패널에 나타나는 노인반의 수가 로그함수로 증가하도록 선택하였다. 이러한 선택 기준을 적용하게 되면 노인반 축적 정도가 비교적 적을수록(등급이 낮을 수록) 더 많은 구별 등급이 부여되는 셈이되어 더 정밀한 등급 분석을 할 수 있는 특징이 있다. Tg2576 마우스에서와 유사한 기준을 적용하여 Tg-APPswe/PS1dE9 의 뇌조직에 나타나는 노인반이 6 등급에 따라 점진적으로 증가하는 6-등급 노인반 이미지 패널을 완성하였다. 먼저 두 종류의 알츠하이머병 동물 모델의 뇌조직에서 노화가 진행되면서 증가하는 노인반의 축적 정도를 6-등급 노인반 이미지 패널을 방법과 컴퓨터 기반 이미지 분석 프로그램을 이용한 방법으로 비교 분석하여 6-등급 노인반 이미지 패널 방법이 뇌조직에 축적되는 노인반 분석에 유용하다는 것을 보였다. 최종적으로 Tg2576 마우스와 Tg-APPswe/PS1dE9 마우스 뇌조직에 축적되는 노인반의 특성을 6-등급 노인반 이미지 패널을 방법과 컴퓨터 기반 이미지 분석 프로그램을 이용한 방법으로 비교 분석한 결과 유사한 양의 노인반이 축적되는 것처럼 보이더라도 Tg2576 마우스 뇌조직에서는 다수의 작은 크기의 노인반이 발견되는 반면 Tg-APPswe/PS1dE9 마우스 뇌조직에서는 상대적으로 큰 노인반이 축적이 많이 나타나는 것을 알 수 있었다. 본 연구는 부수적으로 6-등급 노인반 이미지 패널 분석법의 유용성을 제시할 수 있었다. 전형적으로 많이 쓰이는 컴퓨터 프로그램을 통한 노인반 분석 방법의 경우 시간이 많이 걸리고 어려운 작업이지만, 이미지 패널을 이용한 분석법은 전문적인 지식이 없더라도 누구나 쉽고 빠르게 측정할 수 있는 특징이 있다. 뿐만 아니라 뇌조직이 손상되거나 준비된 뇌조직 샘플의 염색이 너무 진하게 되는 경우에 컴퓨터 프로그램을 이용할 때 문제가 될 수 있으나 이미지 패널 분석법을 이용한 경우에는 이러한 어려움 없이 노인반 측정이 가능하다.