Study on the signaling pathways regulating osteogenesis and osteoclastogenesis

Abstract

PART I : Glycogen synthase kinase 3β promotes osteogenic differentiation of murine adipose-derived stromal cells Although the role of glycogen synthase kinase 3β (GSK3β) in osteogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BMSCs) is well-characterized as a negative regulator of β-catenin, its effect on osteogenesis of adipose-derived stromal cells (ADSCs) is poorly understood. Here, we show that GSK3β positively regulates osteogenic differentiation of murine ADSCs. Gain-of-function studies showed that GSK3βpromotes in vitro osteogenesis of ADSCs. Regulation of GSK3β activity in ADSCs, either by small interfering RNA (siRNA)-mediated GSK3β silencing or by pharmacological inhibitors, blunted osteogenesis and the expression of osteogenic markers. Importantly, we demonstrated that transgenic mice, engineered to overexpress the constitutively active GSK3β (GSK3β-S9A) mutant, exhibited a marked increase in osteogenesis, whereas expression of the catalytically inactive GSK3β (GSK3β-K85A) in mice inhibits osteogenic differentiation. Molecular analyses showed that the enhanced osteoblast differentiation induced by GSK3β was mediated by downregulation of β-catenin. Remarkably, β-catenin silencing enhances osteogenesis and osteoblast marker gene expression such as alkaline phosphatase (ALP) and osterix. Taken together, these findings demonstrate a novel role for GSK3β in the regulation of osteogenic differentiation in ADSCs. PART II : IL-6 is produced by adipose-derived stromal cells and promotes osteogenesis Although Toll-like receptors (TLRs) have been implicated in the regulation of stem cell functions, their role in osteogenic differentiation of adipose-derived stromal cells (ADSCs) has not been reported. We found that ADSCs express a restricted subset of TLRs, including TLR1-TLR5, and that TLR agonists such as Pam3CSK4 (TLR1/2 agonist), poly-IC (TLR3 agonist), LPS (TLR4 agonist), and flagellin (TLR5 agonist), but not R848 (TLR7/8 agonist), consistently induced osteogenic differentiation in murine-derived ADSCs, which coincided with the TLR expression pattern of ADSCs. Cytokine expression profiles induced by TLR agonists and results from subsequent functional assays indicated that interleukin-6 (IL-6) together with soluble IL-6 receptor (sIL-6R) enhanced osteogenic differentiation of ADSCs by activating STAT3. Small interfering RNA (siRNA)-mediated STAT3-silencing blunted osteogenesis and the expression of osteogenic markers, whereas STAT3 overexpression resulted in an increase in osteogenesis. Consistently, STAT3 inhibitor treatment reduced osteogenesis, STAT3 phosphorylation, and expression of osteogenic markers including osterix. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays indicated that STAT3 binding to the STAT3-binding sites on the osterix promoter increased during IL-6-stimulated osteogenesis. Our results thus establish TLRs as novel regulators of ADSCs which signal through IL-6/STAT3 pathway and induce osterix expression as a part of the osteogenesis. PART III : A crucial role of SIRT3 during RANKL-mediated osteoclast differentiation Osteoclasts are multinucleated cells of hematopoietic origin that decalcify and degrade the bone matrix. They are in a state of high energy demand and possess abundant mitochondria. Despite the important link between mitochondrial biogenesis and osteoclastogenesis, the molecular mechanism remains poorly understood. Here, I report that SIRT3, a mitochondria-localized sirtuin, is a key regulatory molecule for osteoclastogenesis. Peroxisome-proliferator-activated receptor-γ co-activator-1β (PGC1β) together with receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL)-induced the expression of SIRT3. SIRT3 overexpression in osteoclast precursor cells exhibited a decrease in osteoclast differentiation, whereas SIRT3-/- osteoclast precursor cells underwent increased osteoclastogenesis. Furthermore, SIRT3-/- osteoclast precursor cells reduced AMP-activated protein kinase (AMPK) phosphorylation via downregulated the expression of AMPK that plays a key role in regulating cellular energy metabolism during osteoclast differentiation. These data demonstrated that SIRT3 is a negative regulator of osteoclast differentiation through regulating ATP levels and AMPK activity.;골격계는 뼈를 형성하는 조골세포와 뼈를 흡수하는 파골세포의 조율에 유지된다. 조골세포는 지방세포, 연골세포, 섬유아세포 등의 세포로 분화할 수 있는 중간엽 줄기세포로부터 분화되어, 지지 단백질을 생성하고 미네랄을 축적하여 뼈를 형성한다. 이러한 조골세포로부터 발현된 사이토카인인 RANKL은 조혈모세포로부터 거대 다핵세포인 파골세포로의 분화를 매개한다. 파골세포에 의해서 생성된 산성화와 단백질 분해효소들은 미네랄을 녹이고 뼈의 구성 단백질을 분해함으로써 뼈 흡수가 일어난다. 이러한 조골세포와 파골세포의 작용으로 인체를 구성하고 있는 오래된 뼈는 흡수하고 새로운 뼈를 형성하는 과정이 지속적으로 일어나 항상성을 유지하고 있으며, 두 세포간의 불균형은 골화석증과 골다공증 등의 질환을 초래한다. 본 논문에서는 지방조직 유래의 지방줄기세포로부터 조골세포로의 분화에 관여하는 GSK3β와 TLRs/STAT3 세포신호전달과정과 파골전구세포로부터 파골세포로의 분화 과정에서 SIRT3 단백질의 역할에 대해서 연구하였다. 논문의 첫 번째 장에서는 Wnt 신호전달과정의 조절단백질 중 글리코겐 합성효소 인산화효소인 GSK3β가 지방조직 유래의 지방줄기세포의 조골세포로의 분화에 미치는 영향에 대해 연구하였다. GSK3β를 과발현시킨 줄기세포는 조골세포로의 분화가 증가된 반면, GSK3β의 인산화 기능을 없애버린 비활성형 돌연변이를 과발현시키거나 짧은 간섭 RNA를 통해 GSK3β의 발현을 억제시킨 경우 조골세포의 형성이 억제되었다. 또한 GSK3β의 활성형돌연변이를 과발현하는 유전자 조작 생쥐로부터 유래한 줄기세포의 조골세포로의 분화는 증가한 반면, GSK3β 비활성형 돌연변이를 과발현하는 유전자조작 생쥐의 경우 분화능이 감소함을 확인함으로써 GSK3β가 조골세포 분화를 촉진하는 역할을 함을 알 수 있었다. 더불어 이러한 GSK3β에 의한 조골세포로의 분화능은 GSK3β에 의해 매개되는 세포 내 단백질인 β-catenin에 의해 영향을 받는다. 따라서 GSK3β는 지방조직 유래의 지방줄기세포의 조골세포로의 분화를 증가시키는 데 관여하는 것임을 규명하였다. 두 번째 장에서는 지방조직 유래의 지방줄기세포에서 발현하는 Toll-like receptors (TLRs)가 조골세포로의 분화능에 미치는 영향에 대해서 연구하였다. 지방조직 유래의 지방줄기세포에는 TLR1-TLR5가 발현되어 있으며, 각각의 활성화 인자에 의해서 조골세포로의 분화가 증가하고 IL-6 사이토카인의 발현량이 증가하였다. 또한 IL-6를 세포에 처리해 주었을 때 조골세포로의 분화가 증가하고 세포 내 전사인자 단백질 STAT3의 활성화와 핵으로의 이동이 증가하였다. 게다가 STAT3의 발현을 억제시킨 경우 조골세포로의 분화가 증가하고 과발현시킨 경우 분화가 감소함을 확인하였다. 또한 STAT3는 조골세포의 분화에 관여하는 주요한 전사인자 osterix의 promoter 부분에 직접적으로 결합하여 전사를 조절하는 것을 확인하였다. 이로써, 지방조직 유래의 지방줄기세포에서 발현하는 TLRs은 IL-6/STAT3 신호전달과정을 통해 osterix의 발현을 증가시킴으로써 조골세포 분화에 영향을 미치는 것을 밝혔다. 세 번째 장에서는, 세포 내 미토콘드리아에 존재하는 NAD+-의존적 히스톤 탈아세틸화 기능을 가지고 있는 단백질 SIRT3가 파골전구세포로부터 파골세포로의 분화에 미치는 영향을 알아보았다. SIRT3는 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화과정에서 발현이 증가하는 것을 보았고, SIRT3를 파골전구세포에 과발현시킨 경우 파골세포로의 분화가 억제되는 것을 확인하였다. 또한, SIRT3 유전자가 제거된 SIRT3-/-로부터 유래한 파골전구세포의 파골세포 분화능이 증가되어 있음을 확인함으로써 SIRT3가 파골세포로의 분화과정에 억제인자로 작용하는 것임을 알 수 있었다. 더불어 SIRT3-/-로부터 유래한 파골전구세포의 파골세포 분화 과정에서 세포내 인산화효소인 AMP-activated protein kinase (AMPK)의 발현과 활성이 감소하는 것을 확인하였다. AMPK는 파골세포 분화에 억제인자로 알려져 있다. 따라서, SIRT3는 AMPK의 발현을 조절함으로써 파골전구세포로부터 파골세포로의 분화에 억제인자로 작용함을 규명하였다.