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Identification of novel genes responsible For multiple tolerance By transposon mutagenesis In Saccharomyces cerevisiae

Title
Identification of novel genes responsible For multiple tolerance By transposon mutagenesis In Saccharomyces cerevisiae
Authors
김나래
Issue Date
2012
Department/Major
대학원 생명·약학부생명과학전공
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Advisors
최원자
Abstract
에탄올, 고온, 저해제 스트레스 상황에서 내성을 가지는 사카로마이세스 세레비지아에 균주는 에탄올 생산 산업을 위해 중요한 부분을 차지한다. 본 연구에서는 에탄올 15 % 까지 내성을 가지는 5개의 균주를 트랜스포존에 의해 돌연변이가 일어난 집단에서 테스트를 통해 분리했다. 5개중에 2개는 고온 (42 °C)에도 내성을 가지는 것을 조사되었고, 그 중에서 1개는 푸르푸랄 50 mM까지 내성을 가지는 것을 확인했다. 트랜스포존이 끼워 들어간 위치를 통해 7개의 추정 유전자 (CMP2, IMD4, SSK2, PPG1, DLD3, PAM1, MSN2)를 확인하고, 노던 블럿 분석법을 통해 CMP2와 IMD4, SSK2와 PPG1유전자가 동시에 하향조절 되었고, DLD3 유전자또한 하향조절, PAM1과 MSN2의 전사 해독 틀이 깨져있는 것을 확인 할 수 있었다. 이 7 유전자가 독립적으로 망가진 돌연변이는 에탄올 내성이 있었고, 그들 중 3개의 유전자 (SSK2, PPG1, PAM1)은 고온에도 내성이 있었다. 또한 이들 중 1개 (SSK2)는 푸르푸랄에 내성을 가졌다. 이런 내성 표현형은 각각의 유전자를 발현 또는 과발현 시켰을 때 스트레스에 민감한 표현형으로 돌아갔다. 5개의 트랜스포존 돌연변이는 30 %의 글루코오즈와 6%의 에탄올을 첨가한 완전 배지에서 배양했을 때 대조군에 비해 에탄올 생성량이 높고 더 빨리 자랐다. 그 중에서 2개의 고열 내성이 있는 트랜스포존 돌연변이 (Tn 2, Tn 3)는 42 °C에서 대조군에 비해 상당히 빨리 자라고 에탄올 생성량이 증가되는 것을 보였다. 1개의 푸르푸랄에 내성을 가지는 트랜스포존 돌연변이는 30 mM에서 푸르푸랄이 포함된 완전배지에서 대조군에서 에탄올 생산량이 더 높고 더 빨리 자랐고, 푸루푸랄은 푸르푸릴 알코올로 빠르게 변환되었다. 또한 푸르푸랄 내성 돌연변이는 ROS 축적량이 줄었고 Hog1p는 빠르게 활성화 되었고 이는 ROS를 줄이는 반응에 기여한다. 본 연구에서 유전자의 확인은 산업적으로 효모균주의 활용 발달에 기초를 제공할 것이다.;Saccharomyces cerevisiae strains tolerant to ethanol, heat and inhibitor stresses are important for industrial ethanol production. In this study, five strains (Tn 1?5) tolerant to up to 15% ethanol were isolated by screening a transposon-mediated mutant library. Two of them displayed tolerance to heat (42?C). One of them identified tolerance to furfural up to 50mM.The determination of transposon insertion sites and Northern blot analysis identified seven putative genes (CMP2, IMD4, SSK2, PPG1, DLD3, PAM1, MSN2) and revealed simultaneous down-regulations of CMP2 and IMD4, and SSK2 and PPG1, down-regulation of DLD3, and disruptions of the open reading frame of PAM1 and MSN2, indicating that ethanol, furfural and/or heat tolerance can be conferred. Knockout mutants of these seven individual genes were ethanol tolerant, three of them (SSK2, PPG1, and PAM1) were tolerant to heat and one of them (SSK2) were tolerant to furfural. Such tolerant phenotypes reverted to sensitive phenotypes by the autologous or overexpression of each gene. Five transposon mutants showed higher ethanol production and grew faster than the control strain when cultured in rich media containing 30% glucose and initial 6% ethanol at 30?C. Of those, two thermo-tolerant transposon mutants (Tn 2 and Tn 3) exhibited significantly enhanced growth and ethanol production compared to the control at 42?C. One furfural-tolerant transposon mutants (Tn2) showed higher ethanol production and grew faster than the control strain when cultured in rich media containing 30mM furfural and converted furfural into furfuryl alcohol quickly. Also, furfural-tolerant mutant reduced the accumulation of ROS and Hog1p was rapidly activated in response to the presence of furfural, which apparently contributes to ROS reduction. The genes identified in this study may provide a basis for the application in developing industrial yeast strains.
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