Effects of new drug candidate for neuropathic pain on neuronal outgrowth and phosphorylation of collapsin response mediator protein 2

Abstract

비정상적인 신경들 간의 연결 및 신경세포 성장(neuronal outgrowth)은 신경병증성 통증이나 간질을 유발하는 병인기전 중의 하나로 여겨지고 있다. Brain-derived growth factor (BDNF) 나 nerve growth facotr (NGF)와 같은 신경성장인자들의 작용으로 인해 발생하는 신경섬유의 outgrowth의 증가는 중추 민감성을 유발시켜 신경병증성 통증의 원인이 된다고 알려져 있으므로 이러한 신경성장인자들의 작용을 조절하는 것이 통증을 억제하는 중요한 기전이 될 수 있다. 최근 신경병증성 통증 치료제로 개발된 신약후보물질인 compound X는 동물의 여러 통증 모델에 효능이 입증되었으나 기전은 아직 밝혀지지 않았다. 최근 프로테오믹스 친화력 표지 테크닉(proteomic affinity-labeling techniques)을 이용하여 collapsin response mediator protein 2 (CRMP-2)가 이 물질의 여러 결합단백질들 중 하나라는 것이 관찰되었다. CRMP-2는 신경세포 수상돌기의 성장 방향을 결정하는데 중요한 역할을 하는 인산화 단백질이며 CRMP-2의 인산화는 신경성장인자들에 의해 조절될 수 있다는 보고가 있다. 또한, CRMP-2의 인산화는 GSK-3β에 의해 조절되고 인산화된 CRMP-2의 감소는 CRMP-2가 가지는 신경세포의 성장기능이 감소됨을 의미하며 이러한 일련의 반응에는 신경성장인자가 관여된다. 따라서, compound X의 결합 파트너인 CRMP-2가 신경성장인자들에 의한 신경병증성통증을 조절할 수 있는 타겟 단백질로서의 역할을 수행할 가능성을 추측할 수 있으며 이러한 작용이 compound X의 새로운 mode of action이 될 수 있음을 시사한다. 본 연구에서는 BDNF에 의해 변화하는 CRMP-2와 GSK-3β의 인산화를 먼저 확인하고 compound X가 BDNF에 의해 유도된 반응을 억제시킬 수 있는지를 확인하였다. HT-22 세포주를 이용한 실험에서 BDNF에 의해 CRMP-2의 인산화는 감소하고 GSK-3β의 인산화가 증가됨이 확인되었으며 이렇게 유도된 변화는 compound X에 의해 억제됨이 관찰되었다. 더불어 CRMP-2 자체의 발현정도도 compound X에 의해 일부 감소되는 결과가 관찰되었다. NGF를 이용한 morphology 관측 실험에서는 NGF에 의해 증가된 neurite의 길이가 고농도의 compound X에 의해 짧아지는 현상이 PC12 세포주에서 관찰되었다. 이번 연구결과는 compound X가 GSK-3β를 경유하는 CRMP-2의 인산화와 neuronal outgrowth 조절을 통해 활성조절에 기여할 수 있으며 이러한 기전을 통해서 신경성장인자의 자극으로 활성화된 CRMP-2에 의해 유도될 수 있는 비정상적인 신경세포의 성장으로 인한 신경병증성 통증을 감소시킬 수 있다는 가능성을 시사해준다.;Erroneously enhanced neuronal outgrowth which can be induced by neurotrophic factors like brain derived neurotrophic factor (BDNF) or nerve growth factor (NGF) has been implicated in the pathophysiology of chronic pain. Compound X was developed as a novel analgesic drug candidate, especially for neuropathic pain but its mechanism of action is still unclear. Employing proteomic affinity-labeling techniques, collapsin-response mediator protein 2 (CRMP-2) was identified as one of potential binding partners with this compound. CRMP-2 has been shown to be involved in neuronal differentiation, polarization and axonal outgrowth induced by the neurotrophic factors. Dysregulation of CRMP-2 can be implicated in the development of neuropathic pain and epilepsy. Phosphorylation of CRMP-2 at Thr-514 by GSK-3βbecomes CRMP-2 inactive, and active, nonphosphorylated CRMP-2 has been known to enhance axonal outgrowth. In this study, effects of Compound X on the neurite formation induced by NGF and phosphorylation of CRMP-2 via GSK-3β activation induced by BDNF were investigated to elucidate a new mechanism of action for the analgesic activity of the compound. Treatment of NGF in PC12 cells induced a neurite formation, and the length of neurites formed by NGF (25 ng/ml) was observed to be shortened by Compound X (0.5, 1 mM), indicating that this compound could inhibit the CRMP-2 mediated effects of NGF on neurite outgrowth. BDNF is known to trigger a transduction cascade, which regulates the activity of intracellular kinases, resulting in increased levels of active nonphosphorylated CRMP-2 via decreased GSK-3β activity (by phosphorylation of GSK-3β). In the present study, the treatment of BDNF (100 ng/ml) in hippocampal cell lines, HT-22 increased phosphorylation of GSK-3β, whereas decreased the level of phosphorylated CRMP-2 at 10 min and 60 min. Compound X alone produced no significant changes in levels of expression and phosphorylation of GSK-3β and CRMP-2. When cells were treated with Compound X and BDNF, it was observed that Compound X inhibited the BDNF-induced increase in GSK-3βphosphorylaiton at 60 min and decreased the level of CRMP-2 expresssion with slight increase of CRMP-2 phosphorylation. These findings suggest the role of Compound X in regulating CRMP-2 function in neuronal outgrowth.How this regulating effect of Compound X on CRMP-2 mediated function leads to the disease (neuropathic pain) modifying effects remains to be further studied.