Application of HPLC methods for determination of EW-7197 and its salt in rat plasma and comparison of their pharmacokinetics

Abstract

본 연구에서는 쥐의 혈장에서의 EW-7197을 검출하기 위하여 HPLC-UV 분석법을 확립 및 검증하였으며, EW-7197의 free form과 salt form을 정맥 및 경구로 투여하였을 때 EW-7197의 체내 동태에 어떠한 영향을 미치는지를 알아보고자 하였다. 또한, 생명공학연구원에서 얻은 같은 쥐의 혈장에서의 HPLC-MS/MS 결과를 토대로 본 연구에서 확립한 HPLC-UV 결과와 비교하여 좀더 간편하고 사용하기 쉬운 분석법을 개발하고자 하였다. 쥐의 혈장에서의 EW-7197을 정량하기 위하여 혈장 중 EW-7197과 내부표준물질인 EW-7214를 추출액인 메탄올을 사용하여 한번에 추출하였다. EW-7197과 내부표준 물질의 유지시간은 각각 19.4분 및 30.7분이었으며, 이 분석조건에서 EW-7197과 내부표준 물질은 기타 혈장성분들과 잘 분리되었다. EW-7197의 검량선은 0.05-10 μg/mL의 농도 범위에서 양호한 직선성을 나타내었으며, 정량한계를 포함한 농도 (0.05 μg/mL)에서 일내 및 일간 정밀성은 11% 및 9.9% 이하이었고, 정확성은 90.2-100.4%를 나타내어 본 분석법이 혈장 중 EW-7197을 검출하는데 충분한 감도, 정확성 및 정밀성을 갖고 있음을 보여주었다. EW-7197과 EW-7197&#8226;HCl을 10 mg/kg로 경구 투여한 결과, EW-7197의 경우 최고 혈장 중 농도(Cmax)가 EW-7197&#8226;HCl에 비해 현저히 감소하였고 최고 혈장 중 농도에 도달하는 시간 (Tmax)은 현저히 증가하였으나, 그 외 모든 약동학적 파라미터들과 절대 생체이용률에서 있어서 EW-7197와 EW-7197&#8226;HCl 간에 유의한 차이는 나타나지 않았다. EW-7197을 HPLC-UV로 정량하였을 때의 정량한계는 0.05 μg/mL이었고, HPLC-MS/MS로 정량하였을 때의 정량한계는 0.0195 μg/mL로 HPLC-MS/MS로 더 낮은 농도까지 정량이 가능하였지만, 두 분석법에서 얻은 EW-7197의 혈장 중 약물농도의 경시적 변화 및 약동학적 파라미터들에서 통계적으로 유의한 차이가 나타나지 않았다. 이를 통해서 HPLC-UV로도 충분히 정확하고 정밀한 EW-7197 분석이 가능함이 증명되었다. 결론적으로 본 연구에서 확립한 EW-7197의 HPLC-UV 분석법은 HPLC-MS/MS 방법보다 감도는 약간 떨어지나 특이성, 직선성, 정밀성 및 정확성이 검증되었고, 약동학 실험 후 얻어진 혈장 샘플에서 EW-7197 농도를 검출하는데 있어 HPLC-MS/MS 분석법과 큰 차이 없이 효과적이라는 것을 입증하였다. 또한 EW-7197은 물에 난용성이나 경구로 투여 시 위산에서 충분히 녹아 위장관 흡수가 가능하고 Cmax 및 Tmax를 제외한 다른 약동학적 파라미터들에 영향을 미치지 않으므로, 유기 용매 하에서 EW-7197를 salt form으로 만들기 위한 노력이 더 이상 필요하지 않다는 결론을 얻게 되었다.;The purpose of this study was to evaluate pharmacokinetic properties of EW-7197 with poor water solubility and EW-7197&#8226;HCl with improved water solubility. Despite improved solubility profiles in EW-7197&#8226;HCl, we investigated whether the oral administration of EW-7197 has advantages over the use of EW-7197&#8226;HCl in terms of its purity and its use in dosage forms. When EW-7197 was given orally to rats, its Tmax (0.44 ± 0.22 h) was significantly longer than that of EW-7197&#8226;HCl (0.18 ± 0.07 h; p < 0.05) and the Cmax of EW-7197 (0.81 ± 0.65 μg/mL) was significantly lower than that of EW-7197&#8226;HCl (1.79 ± 0.96 μg/mL; p < 0.05). Because EW-7197 needed dissolving time in gastrointestinal (GI) fluid, its Tmax was longer and the Cmax was lower than its salt form. However, there were no statistically significant differences between the two groups on the other pharmacokinetic parameters thereby significant difference was not observed in absolute bioavailability (%) between EW-7197 (34.8%) and EW-7197&#8226;HCl (43.0%). In the present study, HPLC-UV method was used and validated for the determination of EW-7197 in rat plasma. In the sensitivity test, the LLOQ of HPLC-UV method was determined to be 0.05 μg/mL, whereas the LLOQ of HPLC&#8211;MS/MS method was determined to be 0.0195 μg/mL. HPLC-MS/MS method could determine lower LLOQ than HPLC-UV method but there were no statistically significant differences between two methods on the mean plasma concentration-time profiles and the all pharmacokinetic parameters. The close agreement of results obtained by the HPLC-UV and HPLC-MS/MS methods indicated that HPLC-UV method could provide excellent sensitivity and selectivity for the analysis of EW-7197 in rat plasma. In conclusion, a simple HPLC-UV method was developed and validated successfully for the analysis of EW-7197 compared to HPLC-MS/MS method. Through the present study, we could develop validated HPLC-UV method and select EW-7197 to conduct the preclinical trial for developing a novel ALK5 inhibitor as a solid dosage form.