Functional studies of human Fas-associated factor 1, hFAF1, on the N-end rule pathway

Abstract

Human Fas-associated factor 1 (hFAF1)은 apoptosis signaling complex의 구성 요소로써 Fas에 결합하는 단백질로 알려졌다. 우리는 이전의 연구를 통해 hFAF1이 ubiquitin-associated (UBA) domain, ubiquitin-like (UBL) domain and ubiquitin regulatory X (UBX) domain과 같은 ubiquitin과 관련된 domain을 가진 ubiquitin receptor임을 알아냈다. hFAF1의 UBA domain은 Lys48-linkage의 polyubiquitination된 단백질과 주로 결합한다. UBL1 domain은 heat shock protein70 (Hsp70)와 결합하여 그것의 chaperone 활성을 조절하고, UBX domain은 valosin-containing protein (VCP)과 결합한다. 우리는 이번 연구에서 hFAF의 UBA domain에 결합하는 binding partner로써 E3 ubiquitin-protein ligase UBR2, UBR4, UBR5와 ubiquitin proteasome system (UPS)에 관련된 여러 단백질을 찾아냈다. N-end rule pathway에서 UBR1, UBR2, UBR4, UBR5가 N-recognin으로 명명되어 E3 ligase로 작용하기 때문에, N-end rule의 기질로 알려진 regulators of G protein signaling 4 (RGS4) 단백질의 분해를 조절하는데 hFAF1이 어떠한 역할을 하는지 연구하였다. 그 결과, hFAF1이 RGS4가 분해를 저해 한다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, ROSpath의 pattern match 기능을 이용해 단백질 데이터베이스인 SWISS-PROT을 검색하여 RGS4와 비슷한 N-end rule 기질로 추정되는 단백질을 찾아보았다. 찾은 단백질 중에서 FABP4를 기질로 이용하여 N-end rule pathway에 있어서 hFAF1의 작용에 대해 더 실험 해 본 결과, RGS4에서의 결과와 동일하게 hFAF1의 저해 효과를 확인할 수 있었다. N-end rule pathway에 대한 이러한 hFAF1의 저해 효과를 더욱 알아보기 위하여 우리는 다양한 hFAF1의 UBA mutant를 사용하였다. hFAF1의 UBA domain에 polyubiquitin이 결합하는 기능에 결함이 있더라도, UBR2, UBR4나 UBR5와 상호작용하여 단백질의 분해를 저해함에 있어서 hFAF1의 UBA domain이 필수적임을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 우리는 hFAF1의 UBA domain에 UBR이 결합함으로써, hFAF1이 N-end rule의 기질 단백질 분해를 조절하는데 중요한 역할을 한다는 것을 증명하였다.;Human Fas-associated factor 1 (hFAF1) was initially identified as Fas-associating molecule and a component of the apoptosis signaling complex [1]. Our previous studies registered hFAF1 protein as an ubiquitin receptor having several ubiquitin-related domains including an ubiquitin-associated (UBA) domain, two ubiquitin-like (UBL) domains and an ubiquitin regulatory X (UBX) domain [1, 2]. UBA domain of hFAF1 recruits and accumulates specifically Lys48-linked polyubiquitinated proteins. UBL1 domain is interacting with heat shock protein 70 (Hsp70) and negatively regulates its chaperone activity, and UBX domain with valosin-containing protein (VCP) [2, 3]. This study presents the novel interactions of hFAF1 UBA domain with some proteins related ubiquitin proteasome system (UPS) and E3 ubiquitin-protein ligase UBR2, UBR4 and UBR5 and biological function of these interactions. We investigated whether hFAF1 plays a role to regulate the proteolysis of N-end rule substrate, RGS4, because UBR1, UBR2, UBR4 and UBR5 are acting as E3 ligase (N-recognin) of N-end rule pathway. It turns out that hFAF1 negatively regulates the proteolysis of RGS4. We newly attained another potential N-end rule substrate like RGS4 by searching SWISS-PROT protein database using pattern match tool of ROSpath. FABP4 as a putative N-end rule substrate was employed for further studies and same results as RGS4 were obtained. Various UBA mutants were employed for examining the negatively regulatory effects of hFAF1 on N-end rule pathway. It was identified that UBA domain regardless of polyubiquitin binding, is required to delay the protein degradation by interactions with UBR2, UBR4 or UBR5. These results suggest that hFAF1 plays a key role to regulate the degradation of N-end rule substrate though the interaction of hFAF1 UBA domain with UBRs.