Protective role of calpain in kainic acid-induced epilepsy

Abstract

Glutamate is a major excitatory neurotransmitter, which can cause the death of neurons by a mechanism known as excitotoxicity. In particular, kainic acid (KA)-induced status epilepticus is a well-characterized model of excitotoxic neuronal injury, which is a Ca2+-dependent process. Evidences for increased activities of Ca2+-dependent enzymes including calpain and cathepsin have been described upon treatment of ionotropic glutamate agonists such as KA and N-methyl-D-aspartic acid (NMDA). Activation of the calpain induces degradations of its substrates such as GSK-3β, β-catenin and p35, leading to a cell death. However, the involvement of the cell death derived from calpain or cathepsin activation in KA-induced behavioral seizure activities has not been investigated. In the present study, in order to examine the involvement of calpain and cathepsin in cell death and behavioral seizures in KA-induced epilepsy, an inhibitor of both calpain and cathepsin B, E64d, was tested for its anticonvulsive and neuroprotective effects in rats injected with KA intrastriatally and intraperitoneally. In this work, calpain activation was characterized by examining the proteolysis of calpain substrates, alteration of calpastatin expression pattern and fluorimetrical analyses. When Male Sprague Dawley rats were injected with 5 nmol and 10 nmol of KA intrastriatally and sacrificed at 1 week after surgery, both concentrations of KA induced grade 5 seizures. In striatal tissues obtained from the KA-treated rats, an increase of calpain activity was observed in a dose-dependent manner by fluorimetrical analyses, and the KA-induced calpain activation was confirmed by the altered expression pattern of an endogenous calpain inhibitor protein, calpastatin. In KA-injected rat striata, western blot analyses for the calpain-induced breakdown products of CRMP-2, GSK-3β and β-catenin also provided an evidence of increased calpain activity which was prevented by E64d, but not by Z-FA-FMK, a specific inhibitor of cathepsin B. CRMP-2 cleavage was also observed in NMDA-treated rat striatum, indicating that NMDA also induced calpain activation. Moreover, the in vivo effect of E64d on KA-induced behavioral seizures of rats was investigated and its anticonvulsant effect was compared with a standard antiepileptic drug, carbamazepine, which is a voltage-gated Na+-channel inhibitor. Pretreatment with E64d significantly prevented KA-induced behavioral seizures in a dose-dependent manner, and E64d produced comparable antiepileptic effect to carbamazepine. The neuroprotective effect of E64d on KA-induced cell death was also assayed by hematoxylin/eosin staining, cresyl violet staining, and western blot analysis of p35, a Cdk coactivator. KA-induced loss of striatal neurons, KA-induced cleavage of p35 to p25 were prevented by E64d. Hence, it is proposed that calpain is involved in neuronal cell death as well as in vivo epileptic behavior induced by KA, and calpain inhibitors can be potentially effective anticonvulsants.;Glutamate은 그 수용체의 과도한 활성에 의해서 신경 괴사를 일으켜 신경을 파괴시키는 흥분성 독성을 유발한다. 특히, glutamate의 ionotropic 수용체 중 non N-methyl-D-aspartate(NMDA) 수용체 효능제들 중 하나인 kainic acid (KA)는 간질 발작을 일으켜서 흥분성 세포 손상을 일으키는 물질로 알려져 있고 이것은 칼슘에 의존적이다. Glutamate의 ionotropic 수용체의 효능제인 KA와 NMDA는 칼슘 의존적 효소들인 calpain과 cathepsin의 활성을 증가시킨다고 보고된 바 있으며 calpain 활동의 증가는 이 효소의 기질인 GSK-3β, β-catenin 및 collapsing response mediator protein-2 (CRMP-2)를 절단시키면서 세포사멸을 유발하는 것으로 알려져 있다. 그러나 KA에 의해 유발된 간질상태에서 KA에 의한 세포 괴사 현상을 유도하는 calpain 활성 증가가 KA로 유도되는 간질 발작 행동에 관여하는 지는 아직 규명되지 않았다. 이번 연구에서는 KA에 의해 유발된 경련모델에서 신경 세포 사멸 및 경련 행동에 calpain의 연관성을 알아보고자 하였다. 이를 위하여 calpain 과 cathepsin B를 동시에 저해하는 E64d를 KA를 투여하기 전에 쥐 뇌 선조체에 주입하거나 복강 내에 투여함으로써 그것의 항 경련 효과와 신경보호 효과를 조사하였다. Calpain 기질의 절단현상과, calpain의 내인성 저해제인 calpasatatin의 형태 변화와, 형광분광학적 분석을 통해 KA에 의한 calpain 활동을 조사하였다. 5 와 10 nmol의 KA를 쥐 뇌 선조체에 직접 주입하여 1주일 뒤에 단두치사 하였더니 두 농도의 KA 모두 5단계의 간질을 유발하였다. 형광분광학적 방법에 의해 calpain의 활동이 KA를 투여한 뇌 선조체에서 농도 의존적으로 증가하는 것이 관찰되었고 이는 calpastatin의 단백질 변화에 의해 확인 되었다. KA을 투여한 쥐의 선조체에서 calpain의 기질인 CRMP-2, GSK-3β, β-catenin이 절단되며, 이 현상이 calpain과 cathepsin의 저해제인 E64d에 의해 차단되지만 cathepsin B를 선택적으로 저해하는 Z-FA-FMK에 의해서는 차단되지 않음을 관찰함으로서, cathepsin은 관여하지 않으며 calpain 이 연관되었음을 또다시 확인할 수 있었다. CRMP-2는 KA 뿐만 아니라 NMDA를 처리한 쥐의 뇌 선조체에서도 절단되었으며 이 결과를 통해 NMDA 또한 calpain 활동의 증가를 유발하는 것을 알 수 있었다. KA에 의해 유발된 간질모델에서 E64d의 in vivo 항 경련효과를 대표적인 항경련제로 사용되고 있는 Na+ 채널 차단제 carbamazepine의 항 경련 효과와 비교하였다. KA를 투여한 쥐 모델에 E64d를 전 처리 했을 때 KA에 의한 경련반응이 농도 의존적으로 감소되었고 E64d의 항경련효과는 carbamazepine보다 효력이 더 높았다. 이 결과로부터 calpain이 KA에 의해 유발된 경련 행동에 관여하고, calpain 저해제는 잠재적으로 효과적인 항 경련제가 될 수 있음을 알 수 있었다. 이와 더불어 본 연구에서는 KA에 의한 신경세포 사멸에 E64d가 보호효과를 나타내는 지를 hematoxylin/eosin, cresyl violet 염색 방법으로 확인했다. KA에 의해 유발된 뇌 선조체 신경괴사는 E64d에 의해 차단되었으며, KA에 의해 Cdk coactivator인 p35의 절단 역시 E64d에 의해 차단되는 경향이 관찰됨으로서 E64d가 뇌신경 보호작용도 가지는 것으로 확인이 되었다. 본 연구에서는 calpain은 KA에 의해 유발된 세포 사망과 in vivo 경련에 관여하며, calpain을 저해함으로써 항 경련효과와 신경보호효과를 나타낼 수 있다는 결과를 얻었다. 후속연구에서는 calpain이 KA에 의해 유발된 경련과 세포사망에 있어서의 정확한 역할이 규명되어져야 할 것으로 사료된다.