Immuno-responsive gene1 (IRG1) induction through TRANCE-Rac1 dependent pathway

Abstract

Osteoclasts are specialized cells derived form the monocyte/macrophage haematopoietic lineage that develop and adhere to bone matrix, then secrete acid and lytic enzymes that degrade it in a specialized, extracellular compartment. Regulation of osteoclast differentiation is central to the understanding of the pathogenesis and treatment of bone disease such as osteoporosis. Discovery the TRANCE/TRANCE-R signaling pathway in the osteoclast has provided insight into the mechanisms of osteoclastogenesis and activation of bone resorption, and how hormonal signals impact bone structure and mass. Further study of this pathway is providing the molecular basis for developing therapeutics to treat osteoporosis and other diseases of bone loss. During the course of our study investigate TRANCE signaling in osteoclast precursors, we found that TRNACE induces Rac1 activation that lead to NF-_(k)B and p38 MAP kinase activation, both of which were known to be critical for osteoclast differentiation. To gain insight into the mechanism of TRANCE-Rac1-specific induction of the osteoclast differentiation program, suppression-subtractive hybridization screening approach was taken to identify genes specifically induced via TRANCE-Rac1 signaling pathway. This resulted in the identification of one TRANCE regulated gene that had been previously found in LPS-stimulated macrophages and called immune responsive gene (IRG) 1 and which is the mammalian ortholog of the bacterial gene encoding methylcitrate dehydratase. In osteoclast precusor cells, IRG1 mRNA was induced by TRNACE through PI3-kinase-Rac1-dependent pathway. Overexpression of GFP-tagged IRG1 was exclusively localized in cytosol. Interestingly, IRG1 expression activates ERK1/2. This activation was inhibited by overexpression of dominant negative (DN) mutant of MEK but not of Rac DN or Raf DN, suggesting IRG1-induced ERK1 activation functions downstream of Raf. Although the detailed functional relevance of IRG1 during osteoclastogenesis remains to be determined, these result suggest that IRG1 protein may function as positive regulator of ERK1/2. ;우리 몸의 뼈는 조골세포 (osteoblast)와 파골세포 (osteoclast) 의 조화에 의해 항상성 (homeostasis) 을 유지한다. 파골세포는 전구체인 대식세포 (macrophage)로부터 분화하여 뼈에 부착하며 산과 분해효소 (lytic enzyme)를 분비한다. 파골세포의 분화조절에 관한 연구는 골다공증과 같은 뼈와 관련된 병의 발병원인을 밝혀내는데 중요한 역할을 한다. 이러한 파골세포 분화에 있어서 TRANCE (TNF-related activation-induced cytokine) 신호전달 과정이 중요한 역할을 한다는 것이 발견되었다. 이러한 TRANCE 자극에 의한 파골세포의 분화과정을 연구하던 중 TRANCE가 small GTPase family중의 하나인 Rac1을 활성화 시키고 이어서 파골세포 분화에 있어서 중요한 NF-_(K)B, p38 kinase를 활성화시킨다는 것을 발견하였다. 그래서 파골세포 분화과정에 있어서 TRANCE-Rac1에 의해 특이적으로 발현되는 유전자를 찾기 위해 suppression-subtractive hybridization screening approach를 수행하였다. 그 결과 여러 개의 유전자를 찾았고 그 중에서 IRG1 (immuno responsive gene1)을 흥미를 갖고 연구하게 되었다. IRG1은 Raw 264.7 cell 에서 LPS에 의해 발현되는 유전자로 첨으로 밝혀졌으며, 박테이리아의 mrthylcitrarte dehydratase와 유사성(homology) 을 가진 PrpD domain을 가지고 있다. IRG1은 progesterone (P4)의 조절을 받는다고 밝혀졌다. IRG1의 발현은 Northern hybridization으로 확인하였다. Raw 264.7 cell 에서는 빠른 시간 내 (15시간 이내) 에 발현된 뒤 감소하였고 Rac1 dominant negative cell 에서는 발현이 억제되었다. LPS 자극에 의해 발현되는 IRG1은 PKC 신호전달 체계를 거친다고 알려져 있으며 PI3-kinase는 세포 내 여러 신호전달에 관여한다. TRANCE자극에 의해 발현되는 IRG1이 이러한 신호전달의 영향을 받는지 알아보기 위해 억제제 (inhibitor)를 이용하여 실험한 결과 IRG1은 TRANCE-PI3K-Rac1 의 신호전달 체계를 거쳐 유전자가 발현되는 것을 알 수 있었다. 또한 IRG1은 IFN에 의해 발현되는 유전자로 알려져 있으나 어떤 과정을 거쳐 발현되는지는 알려져 있지 않다. 그래서 IFN에 의한 IRG1의 유전자 발현이 Rac1에 의존적인가를 Raw 264.7 cell과 Rac DN cell에서 보았으나 차이가 없었다. 결론적으로 IFN에 의한 IRG1의 발현은 Rac1과 상관이 없음을 알 수 있었다. IRG1이 발현되는 위치는 아직까지 알려진 바가 없으므로 TRANCE receptor를 발현하는 293stable cell 에서 IRG1-GFP fusion 단백질을 이용하여 알아보았는데 세포질 (cytosol) 에 존재함을 알 수 있었다. TRANCE 자극이 주어지면 activation- inhibitor of NK-_(K)B kinase (IKK), c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38, extracellular signal-regulated kinase (ERK) and Src pathways가 활성화된다. IRG1이 이러한 신호전달에 관여하는지를 알아본 결과 IRG1자체가 ERK를 활성화 시킴을 알 수 있었다. 이런 활성화는 IRG1의 발현에 의존적으로 증가하는 경향을 보였으며, deletion form (1-313 a.a, 1-234 a.a, 1-70 a.a)을 통해 어는 부분이 중요한 역할을 하는지를 보았는데 세가지 중에서 N-terminal (1-313 amino acid)쪽이 이러한 활성화에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다. ERK가 활성화되는 과정은 Ras-Raf-MEK-ERK 과정이 잘 알려져 있다. IRG1이 이러한 과정에 관여하는 지를 알기 위해 각각의 돌연변이 (mutant) 형인 Ras DN, Raf DN, MEK DN을 이용하여 알아보았다. 그 결과 Ras DN, Raf DN이 과 발현되어도 IRG1이 ERK를 활성화 시키는데 영향을 미치지 못하나 MEK을 과 발현시키면 IRG1이 ERK를 활성화 시키지 못하는 것으로 보아 Raf의 아래 과정 (downstream) 그리고 MEK의 위 과정 (upstream)에 관여 함을 알 수 있었다. 비록 자세한 조절 과정이 좀 더 연구되어야 하기는 하지만 파골세포 분화과정에 있어서 TRANCE-PI3 kinase-Rac1에 의해 발현된 IRG1은 ERK1/2 의 활성화에 positive regulator로 작용 할 것이라 생각할 수 있겠다.