Identification and characterization of expressed genes in Bombyx mori fatbody by analysis of expressed sequence tags

Abstract

항균성단백질은 생물체의 외부 침입병원체들에 대한 선천성 면역체제로써 기여하는 중요한 생체방어인자로써 인식되어오고 있는 단백질이다. 현재까지 알려진 항균성단백질만도 150여개가 넘으며 다양한 계통 진화단계의 동물군들에서 광범위하게 발견됨으로써 포유류 innate immunity 에 존재하는 효과물질의 proto-form이라는 가설과 함께 그 기작도 중요한 연구대상이 되고 있다. 이 실험에서는 한국산 누에의 fatbody에서 외부병원체에 특이적으로 발현되는 새로운 항균성 gene들을 분리해내어 그 기능을 밝힘으로써 곤충의 면역체제연구에 있어 누에의 중요성을 향상시키고자 함에 목적을 두었다. 외부병원체의 침입 후 발현되는 모든 mRNA를 조사하기 위해 E.coli를 누에에 주사후 fatbody의 cDNA library를 제작, EST analysis 를 실시하였다. 총 725개의 clone을 sequencing후, BLAST분석을 한 결과, 높은 homology를 갖는 유전자 중 약 40%정도가 항균성단백질로 구성되었고, 그 중에서도 cecropin-family는 유독 많이 발현되는 단백질군임을 확인할 수 있었다. 이는 cecropin이 누에에게 있어 병원균들로부터 자신을 방어하는 가장 중요한 항균성단백질임을 말해준다. 약 20%의 clone들은 어떤 gene과도 유사성을 보이지 않았으며 이군들 중에 누에에서 특이적으로 발현되는 새로운 항균성 단백질이 존재할 수 있음을 가정하였다. Phylogenetic 분석을 실시한 결과, 항균성단백질간에는 매우 깊은 유연관계가 있음을 확인, 이들과 같은 관계가 있는 clone들을 선택하여 그 항균성을 검증하였다. 이들의 clone들은 기존 단백질의 항균성효율의 농도에서보다 월등히 높은 농도에서 약한 반응을 보였다. 항균성 단백질의 발현조절기작에 대해서 아직 많은 연구가 필요시 되고 있지만, Drosophila를 비롯한 여러 곤충들에서 regulation factor 또는 Toll과 같은 signal transduction pathway에 관여하는 molecules들에 대한 보고가 나오고 있고, 최근에는 Eukaryotic initiation factor 2α (elF-2α) kinase가 누에에서 발견되기도 하였다. 이는 척추동물의 innate immune system과 곤충에서의 innate immunity 간에 매우깊은 유사성이 있음을 말해주는 것일뿐 아니라, 곤충에서도 면역체제에 있어 척추동물과 같은 복잡한 mechanism이 존재함을 뒷받침 해주는 것이다. 이 실험에 있어 EST analysis이 조직특이적으로 발현되는 유전자들의 분리와 발현정보를 제시해주는 유용한 도구임을 확인할 수 있었을 뿐 아니라, 누에의 genome 정보를 해석하는데 기초를 제공할 수 있었다. 앞으로 누에에서 발현되는 새로운 항균성단백질에 대한 지속적인 연구와 함께, 그 mechanism에 관여하는 구체적인 요인들에 대해서도 연구를 해야할 것으로 생각된다. ;To identify specific-induced antibacterial peptide against pathogen (E.coli) in larvae fatbody of B.mori, we have constructed an EST database. Because gene expression patterns deeply depend on tissues as well as developmental stages, we analyzed cDNA libraries prepared from fatbody to cover the induced whole mRNA against pathogen (E.coli) in B.mori larvae. We analyzed 725 clones by sequencing and BLAST similarity search. Forty percent in the high quality sequence was composed of antibacterial protein and cecropin-family was made-up of the highest expressed peptide in that group. Approximately 20% clones showed no similarity to any known genes of expressed sequence tags(EST) and selected clones representing novel ESTs were analyzed by agar-well diffusion assay for their antibacterial activity analysis. However they were not shown to function effectively as peptides to inhibit the growth of bacteria. We concluded that most of expressed molecules induced by E.coli play a role as an antibacterial peptide regulation factor rather than induced-novel antibacterial peptide in larvae fatbody, and also additional molecular events could contribute to the overall activity. In our study showed that ESTs are still a powerful tool to identify differentially expressed genes and provide expression information but also supplied a base for genome annotation of B.mori and further investigation of immune mechanism about presenting the possibility exisiting regulation factors and complex signal pathways supporting expressed antimicrobial proteins.