신호전달체계에 의한dopamine β-hydroxylase(DBH)유전자 발현과 catecholamine 생산의 조절

Abstract

Dopamine β-hydroxylase (DBH) is the enzyme responsible for the synthesis of norepinephrine (NE) and epinephrine (E). Using the primary cultured bovine adrenal medullary cells, the present study attempted to examine the effect of the activation of various intracellular signal transduction pathways on gene expression and activity of DBH and in the availability of catecholamines (CA). Specifically, using specific pharmacological agents, we activated 1) the cAMP-dependent protein kinase A (PKA), 2) the glucocorticoid receptor, 3) the calcium/calmodulin-dependent protein kinase (Ca/CaMKⅡ), 4) the tyrosine kinase receptor and 5) the calcium/phospholipid -dependent protein kinase C (PKC) and determined the biochemical changes by Northern blot analyses, enzyme activity determination and catecholamine quantitation. The PKA activation by the treatment with 50μM forskolin or 100 μM 8-bromo-cAMP resulted in a maximal increase in the steady state DBH mRNA at 6hr while DBH activity(48h) was also increased by 132%, and total NE and E amounts were increased by 195% and 113%, respectively. Interestingly, the treatment with forskolin increased the released NE and E amounts by 10 fold and 6 fold. The activation of glucocorticoid receptor by 10μM dexamethasone treatment did not significantly change DBH mRNA level, activity, or the CA contents. The increase in the intracellular calcium concentration caused a decrese in DBH mRNA level, while DBH activity was increased by 118% and intracellular N32 and E were decreased by 48% and 72%, respectively. The activation of tyrosine kinase receptor by 5nM insulin-like growth factor (IGF-1) treatment increased the DBH mRNA level by 7-8 fold and activity by 154%(72h) and CA amounts by 147%(NE) and 136%(E) at 72h. The activation of PKC pathway by l00nM TPA treatment resulted in no change in the steady state DBH mRNA, but DBH activity was increased by 138%, and intracellular NE and E amounts were changed by 111% and 90% of the untreated control. Taken altogether, activation of PKA and tyrosine kinase markedly increased the DBH mRNA level, along with DBH activity and CA contents indicating that these two signalling pathways may be important in upregulation of DBH gene expression. In comparison, the fact that DBH mRNA is deneased by elevation of intracellular calcium suggests a possibility that Ca/CaMKⅡ activity may be negatively regulating DBH gene expression. On the other hand, activation of glucocorticoid receptor and PKC had little effect, suggesting their minor role in regulation of DBH gene expression.;Dopamine β-hydroxylase(DBH) 는 norepinephrine(NE) 과 epinephrine(E) 의 생합성을 담당하는 효소이다. 본 논문에서는 세포내 여러 신호전달체계의 활성화가 DBH gene expression 과 activity 및 catecholamine(CA) 생산에 미치는 영향을 소의 1차배양 부신수질세포에서 관찰하였다. 그리고 생리활성물질 효과의 세포내 생화학적 기전을 1) 세포내 cAMP농로의 증가를 통한 protein kinase A(PKA) 경로; 2) 지용성호르몬에 의한 표적유전자 발현의 직접 조절; 3) calcium 농도에 따른 calcium/calmodulin-dependent protein kinase (Ca/CaMKⅡ) 기전 ; 4) tyrosine kinase-coupled 수용체를 사용하는 경로 및 5) protein kinase C(PKC) 경로로 분류하여, 각 경로를 활성화 시킨 후 Northern blot analysis 와 assay 및 CA 를 정량하였다. 50μM forskolin과 100μM 8-bromo-cAMP를 사용하여 PKA 경로를 활성화 시켰을때 6시간에서 steady-state DBH mRNA 수준이 가장 증가하였으며 이와 일치하여 DBH activity(48h) 는 132% 가 증가하였고, 전체 CA 양 또한 NE 는 195%, E 은 113% 의 증가가 있었다. 특히 forskolin 에 의해 세포 밖으로 유리되는 NE 는 10배, E 는 6배가 증가하였다. 10μM dexamethasone 을 처리하여 glucocorticoid 수용체를 활성화 시킨경우 DBH mRNA 수준과 activity 및 CA 양 또한 변화가 없었다. l00㎚ A23187 을 처리하여 세포내의 calcium 농도를 증가시켰을 경우 steady-state mRNA 수준이 매우 감소하였으며, DBH activity 는 118%로 증가하였으나 세포내의 CA 양은 NE 가 48%로, E 는 72%로 감소하였다. 5nM insulin-like growth factor 1 (IGF-1) 을 처리하며 tyrosine kinase 수용체를 활성시킨경우 DBH mRNA 수준이 7-8배, activity는 154% (72h) 가 증가하였으며, CA 양(72h) 또한 NE 가 147%, E는 136% 증가하였다. 100㎚ TPA를 사용하여 PKC 경로를 활성화 시켰을 경우 steady-state DBH mRNA 는 변화하지 않았으나 activity는 138% 증가하였으며 세포내 NE 는 111% 로 조금 증가하였고, E 는 90%로 감소하였다. 따라서 PKA와 tyrosine kinase 의 활성화가 DBH의 mRNA를 현저히 증가시키며 이와 병행하여 DBH activity 및 CA의 양이 증가하는 것으로 보아 이 두 신호전달체계가 DBH의 유전자 발현 upregulation 에 가장 중요하게 작용하는 것으로 생각된다. 반면 세포내 calcium 농도 증가가 DBH mRNA 를 저하시킨다는 사실을 Ca/CaMKⅡ activity 가 DBH 유전자 관련을 부정적으로 조절하리라는 가능성을 제시한다. 한편 glucocorticoid 와 PKC 를 통한 경로는 DBH 의 유전자 발현에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 판단된다.