알칼리성 Bacillus sp. ALk-7의 α-keto-γ-methylthiobutyric acid (KMBA)로부터 에틸렌 생성에 관여하는 효소의 분리 정제 및 특성

Abstract

Ethylene을 생성하는 알칼리성 토양세균 Bacillus sp. Alk-7의 α-keto-γ-methylthobutyric acid (KMBA)로부터 ethylene을 생성하는 Ethylene-Forming Enzyme(EFE)룰 분리 정제하여 그 촉매적 특성을 조사하였다. 알칼리성 세균의 ethylene 생성에 관해서는 아직 보고된 바 없으며 본 분리 세균의 ethylene 생성에 관여 하는 효소인 EFE는 30℃에서 24시간 동안 배양한 Bacillus sp. Alk-7 65g bead-beater로 파쇄 하여 조효소계를 조제 하고, Streptomycin sulfate 침전, Sephacryl S-200 HR, DEAE-Cellulose, Butyl-Toyopearl 650M column chromatography 을 통해 부분 정제하였다. 그 결과 약 1000배의 순도로 정제 하였으며 0.1 % SDS를 포함하는 10 % polyacrylamide gel에서 전기 영동 결과 subunit의 분자량은 39,000 daltons으로 추정되었다. 이 효소의 최적 ph는 6.8이고 최적 반응 온도는 35℃이며 2가 양이온인 Mg^(2+), Zn^(2+)에 의해 활성이 증가 되어 진다. 이 효소는 기질 KMBA에 대해 ㎞은 6.45 mM이고 Vmax는 41.7 nl/㎎ protein hr 이었다. Bacillus sp.Alk-7은 기질 L-Methionine (L-Met) 과 1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) 에서도 ethylene을 생성하는데 따라서 식물과 같은 생합성 경로로 ethylene을 생성할 것이라는 추정은 사실이 아님을 알 수 있었다. TLC 실험에서 KMBA는 L-Met으로 약간 전환됨을 확인 할 수 있었는데 이것은 ethylene 생합성 경로로 중요한 의미가 있는 것은 아닌것으로 생각된다. 아직 미생물에 의한 ethylene 생성 기작이 정확히 밝혀지지 않고 있는데 Bacillus sp.Alk-7에서의 ethylene 생성경로, 미생물 내에서의 ethylene 역할등의 연구가 더 행해져야 할 것이다.;An alkaophilic Bacillus sp. Alk-7, isolated from soil, produced ethylene. The characteristic of this microorganism is the ability to grow well in alkalophilic condition, that is at pH 10.3. This strain is similar to Bacillus alkalophilus if morphological, physiological and biological characteristics were compared. Methionine which is known as the precursor of ethylene in plant, has some effect on ethylene production by the Baci 1 lus sp. Alk-7. 1-Aminocyciopropane-l-carboxylic acid (ACC) and α-keto-γ-methylthiobutyric acid (KMBA) also has great effect on ethylene production. According to Thin layer chromatography and ACC assay method, L-Met didn't transfer to ACC. Transformation of KMBA to Met would not seem to be essential step in ethylene production by Bacillus sp.Alk-7. For the prification of ethylene-forming enzyme, Bacillus sp. Alk-7 cultured in alkalophilic medium for 24hrs and centrifuged 4,300Xg. 65g of cells disrupted by bead-beater. After streptomycin sulfate of cell extract, Sephacryl S-200 HR, DEAE-Cellulose, Butyl-Toyopearl 650M column chromatography have been carried out and the electrophoresis of purified enzyme on 10 % polyacrylamide gel containing 0.1 % SDS resulted in 39,000 daltons protein band. This enzyme was stable at pH 6 - 8. The optimum pH and temperature of this enzyme activity was pH 6.8 and 35℃. This enzyme activity enhanced Mg^(2+), Zn^(2+) and inhibited EDTA. The kinetics of KMBA (Km) was 6.45mM and Vmax was 41.7 nl /mg protein hr. A considerable amount of ethylene was produced with involvement of a non-enzymatic ethylene-forming process in KMBA, Fe^(2+), Co^(2+), and Cu^(2+).