대두(Glycine max L.)유식물에서 protein kinase C의 기질에 대한 연구

Abstract

동물에서와 같이 식물체에서도 IP_(3) cascade가 존재함이 밝혀지고 있으므로 phosphoinositide의 또다른 가수분해 산물인 DAG도 여러가지 생리적인 현상에 관여하리라는 가능성을 생각할 수 있다. Chung(1991)등은 이를 추적하기 위하여 DAG과 유사한 구조를 가지고 있어서 PKC의 Ca^(2+)에 친화도를 증가시키는 TPA를 IAA와 같이 옥수수의 자엽초에 처리하여 길이생장을 알아본 결과 길이생장이 IAA만 있을 때에 비해 증가하였으며 동시에 인산화가 증가됨이 관찰하였다. 이는 PKC가 식물세포 신장 생장에 관여함을 시사하므로 본 연구는 부분적으로 분리한 Ca^(2+), phospholipid-dependent PKC를 이용한 대두유 식물 하배측 정단부와 뿌리에서 각각 분리한 세포질 단백질과 막 단백질의 인산화 실험을 통해 PKC의 기질이되는 단백질을 알아 보았다. PKC는 DEAE-cellulose column을 이용하여 분리하였을때 phosphatidylserine과 diolein을 넣어주지 않은 대조구에 비해 activity가 phosphatidylserine과 diolein을 넣은 경우 5배이상 증가하는 분획으로 얻었다. 이를 이용하여 분리된 세포질 단백질과 막 단백질을 인산화시켰을때 EGTA를 처리한 대조구에 비해 Ca^(2+)을 처리한 경우 인산화의 뚜렷한 증가가 나타났으나 Ca^(2+)에 TPA를 같이 처리한 경우나 Ca^(2+)에 phosphatidylserine과 diolein을 같이 처리한 경우에서는 Ca^(2+)만 처리한 경우에 비해 뚜렷한 인산화의 증가를 보이지 않았다. 이는 PKC가 제대로 활성화되지 않았거나 다른 Ca^(2+) dependent protein kinase에 의한 인산화로 나타날수 있으므로 PKC의 저해제인 STA를 처리하여 본 결과 Ca^(2+), phosphatidylserine과 diolein을 같이 처리한 대조구에 비해 cytosol protein은 100 KD, 63 KD, 41 KD 단백질들의 인산화가 감소하였고 막 단백질은 subapical region의 경우 140 KD, 110 KD, 66 KD, 47 KD, 32 KD단백질들의 인산화가, 뿌리의 경우 140 KD, 110 KD, 66 KD, 47 KD, 33 KD, 31 KD, 17.5 KD 단백질들의 인산화가 감소되었다. 이러한 실험결과를 바탕으로 PKC의 기질은 세포질 단백질의 경우 100 KD, 63 KD, 41 KD단백질들이며, 막 단백질중 하배축 정단부의 경우는 140 KD, 110 KD, 66 KD, 47KD, 32 KD 단백질들이며, 뿌리의 경우는 140 KD, 110 KD, 66 KD, 47 KD, 33 KD, 31 KD, 17.5 KD 단백질들이라 할 수 있다. 아마도 이러한 단백질들중 어떤 것이 식물의 신장 생장과정중 어느 한단계에 관여하리라 여겨진다.;In animal systems, it is well established that inositol-1,4,5-triphosphate (IP_(3)) and diacylglycerol (DAG) are important elements in transmembrane signal trasnduction. Recently in plants, IP_(3) has also become known to mediate Ca^(2+) mobilization from Ca^(2+) sequestering compartments like in animal system. So it may be plausible that the other product of phobphoinositide hydrolysis DAG will activate protein kinase C(PKC) in plants. In an effort to characterize a plant system, substrates of PKC in the cytosol and membranes isolated from the subapical region of hypocotyls and the root were studied using partially purified PKC in Glycine max. PKC was partially purified using DEAE-52 cellulose column. The enzyme activity increased about 5- fold in the presence of Ca^(2+), phosphatidylserine and diolein compared with that in the absence of these reagents. Phosphorylation of both cytosol of membrane proteines by purified PKC increased in the presence of Ca^(2+) compared with EGTA treatment. However, the phosphorylation did not increase markedly by treatment with TPA or phosphatidylserine and diolein in the presence of Ca^(2+) compared with Ca^(2+) alone. A decrease in phosphorylation of 100 KD, 61 KD and 43 KD proteins of the cytosol, and 140 KD, 110 KD, 66 KD, 47 KD and 32 KD membrane proteins in hypocotyls and 140 KD, 110 KD, 66 KD, 47 KD, 33 KD, 31 KD and 17.5 KD membrane proteins in the root was observed in the presence of PKC inhibitor STA. These results indicate that subatrates of PKC in Glycine max were 110 KD, 63 KD and 41 KD proteins of the cytosol, and 140 KD, 110 KD, 66 KD, 47 KD and 32 KD membrane proteins in the subapical region of the hypocotyl and 140 KD, 110 KD, 66 KD,47 KD,33 KD, 31 KD and 17.5 KD membrane proteins of the root.