내열성 Streptomyces violochromogenes D2-5로부터 새로운 제한효소의 분리정제 및 특성에 관한 연구

Abstract

토양 분리 내열성 Streptomyces violochromogenes D2-5로 부터 새로운 제한효소인 Svi Ⅰ을 분리하여 그 촉매적 특성을 조사하였다. 퇴비, 토양의 분리 방선균 70개의 균주에서 제한효소의 활성을 조사하였는데 그 중 E-21-22, S-11, D2-5에서 제한효소의 활성을 찾았다. 이 중 균이 내열성이고 효소가 4℃에서 보관중에 안정한 D2-5에서 제한효소를 분리 정제하였다. 토양 분리 균주인 D2-5는 형태적 특성이나 현미경 관찰, 세포벽의 성분 분석 결과, Streptomyces 속에 속함을 알았고 이 균주의 종수준의 동정을 위해서는 TAXON program을 이용하였다. 이 결과 주군집 18의 Streptomyces violochromogenes가 best match strain으로 나타났다. 따라서 본 분리균을 Streptomyces violochromogenes D2-5로 명명하고 이 균주에서 분리한 제한효소를 Svi Ⅰ으로 명명하였다. 50℃에서 48시간동안 배양한 Streptomyces violochromogenes D2-5 40g을 bead-beater로 파쇄하여 streptomycin sulfate 침전, ammonium sulfate 침전, Phosphocellulose Pll, DEAE-cellulose, Sephacryl S-200 column chromatography를 수행하여 정제하였다. 그 결과 최종 13%의 수율과 93배의 순도로 정제하였으며 0.1% SDS를 포함하는 10% polyacrylamide gel 에서 전기영동 결과를 토대로 분석한 결과 subunit의 분자량은 32,000 dalton으로 추정되었다. 이 제한효소는 넓은 범위의 pH 에서 안정하며 50℃ - 60℃에서 최적 활성을 나타낸다. 활성을 위해 0.2mM의 MgCl_(2)를 필요로 하며 DTT등의 thiol compound와 methylation등에 의해 활성에 영향을 받지 않는다. 이 효소는 온도에 의해 상당히 안정하여 50℃에서 2시간 처리로 활성에 영향을 받지 않으며 Mg^(2+)를 다른 2가 이온으로 대체할 수 없다. Svi Ⅰ은 lambda DNA를 7군데 이상 인식하며 pBR 322, pUC18, pBS등은 자르지 않는다. Svi Ⅰ은 double digestion 하여 절단 지도 작성을 해 본 결과 Asu Ⅱ의 isoschizomer로 보였다. 그러나 Svi Ⅰ은 Asu Ⅱ와는 달리 높은 온도(50℃ - 60℃)에서 활성을 나타내고 50℃에서 2시간의 처리로도 활성을 나타내는등의 온도에 대한 높은 안정성을 나타내었으며 adenosine의 methylation에 의해 기질특이성이 변하지 않는 특성을 갖는다.;Seventy Streptomyces sp. strains were screened for the presence of site specific endonuciease activity. Three strains were observed to have endonuclease activities t o cleave lambda DNA, and D2-5 was chosen because of the stability of enzyme activity from the cell and thermotolerance of the cell. The result of this study showed the identification of Streptomyces sp.D2-5. Furthermore it described the purification and characterization of a new site-specific restrict ion endonuclease. Characteristics of cell culture, morphology and chemical composition of cell wall were analyzed for generic identification of the isolate D2-5. Then numerical identification was carried out by analyzing fifty unit characters using TAXON program containing of database of Streptomyces identification probability matrix for the identification for the species level. The isolate D2-5 was bestmatched to Streptomyces violochromogenes in Streptomyces major cluster 18. So the isolate was identified as Streptomyces violuchromogenes D2-5 to avoid overspecification and the purified endonuclease from St rept omyces violochrumugenes D2-5 was named as Svi Ⅰ. For the purification of this enzyme.40 g of cells were used and distrupted by bead-beater. After streptomycin sulfate and ammoium sulfate fractionation of cell extract, Phosphocellulose P11, DEAE-cel lulose, Sephacryl S-200 column chromatography of crude enzyme have been carried out and the electrophoresis of purified enzyme on 10% polyacrylamide gel containing 0.1 % SDS results in 32,000 dal ton protein band. Svi I shows catalytic activity at wide range of pH 6.5 - pH 9, in presence of 10mM MgCl_(2) and 50mM NaC1. The optimum temperature of Svi Ⅰ is between 50℃- 60℃ ,and it is still active after the preincubation at 50℃ for 2 hours indicating high thermal stability. At least 0.2mM of MgCl_(2) is needed for the Svi Ⅰ activity, but other divalent cation didn't seem to affect the enzymatic activity. The maximal activity of Svi I at 50mM NaCl was observed and the inhibition of Svi I activity also was observed at greater than 125mM NaCl. Neither SH containing chemical nor adenosine methylation does not change the activity and specificity of Svi Ⅰ. Svi Ⅰ cuts 7 sites of lambda DNA but it does not cut pBR 322, pUC8, pBS. The restriction map of lambda DNA with this enzyme was studied and founded that the endoenzyme cleaves the same recognition site of Asu Ⅱ: from Anabaena cyiidrica. Unlike Asu Ⅱ, the activity of Svi Ⅰ shows high thermal stability and is not sensitive to adenosine methylation of substrate. And now the specific recognition and cleavage site is under the investigation using the dideoxy chain termination sequencing method.