알코홀 탈 수소효소의 반응기전에 관한 연구

Abstract

알코홀탈수소효소 (Horse Liver Alcohol Dehydrogenase:HLADH)의 반응에서 효소내 효소 ·조효소·기질평형복합체의 pH의존성과 diethyl pyrocarbonate 처리에 의한 효소활성의 감소 및 잔존효소활성의 pH의존성을 실험한 결과는 다음과 같이 요약할 수 있다. 특정 pH에서 효소·조효소·기질복합체가 이루는 효소내 평형상태에서 존재하는 NADH양과 그 pH에서 효소의 활성부위에 결합이 가능한 최대 NADH양의 비가 pH의존성을 나타내었다. 기질을 변화시켜 각 경우의 pKa를 구하였다. Ethanol:acetaldehyde는 pH7.3, 2-chloroethanol: 2-chloroacetaldehyde는 6.2, anisalcohol:anisaldehyde는 6.7이었다. 평형복합체에 isobutyramide(IBA) 처리에 의하여 유도되는 효소와 결합가능한 최대 NADH양도 pH의존성을 나타내었다. 한편 같은 양의 효소에 대하여 기질의 성질에 따라 HLADH·NADH·IBA에 기인하는 328 nm에서의 최대 흡광도가 차이를 보였다. 흡광도는 anisalcohol : anisaldehyde > benzyl alcohol : benzaldehyde > ethanol: acetaldehyde > 2-chloroethanol: 2-chloroacetaldehyde 순서로 감소하였다. 수식한 효소를 사용한 효소·조효소·기질평형복합체에 diethyl pyrocarbonate(DEP)를 처리시 활성감소는 반응액pH의 영향을 받았다. 사용한 각 기질의 pKa는 다음과 같다. Ethanol : acetaldehyde은 pH 7.7, benzyl alcohol: benzaldehyde 7.6, 2-chloroethanol: 2-chloroacetaldehyde 7.4, anisalcohol: anisaldehyde 7.8이었다. 앞의 결과에서 효소·조효소·기질의 효소내 평형복합체의 pKa는 기질의 화학적 성질을 반영하지 않았으므로 앞으로 연구가 더 진행되어야 할 것이다. 그러나 수식된 효소의 경우 효소·기질·조효소의 평형복합체에 대한 DEP처리에서 구한 효소활성감소 및 잔존활성이 pH변화에 따라 나타나는 pKa는 수식한 효소자체에 대한 DEP 처리에서 구한 pKa 8.0과는 차이를 나타내었다. 이상의 결과로 효소내평형복합체에 대한 DEP 처리후의 pKa는 proton relay system에서 관련하는 His-51 residue의 pKa이며 각 기질의 전자수용의 화학적 성질을 반영한다고 생각할 수 있다.;We examined the pH dependency of internal equilibrium of the ternary complex of horse liver alcohol dehydrogenase(HLADH). The pH effect on the inactivation rate and residual activity from diethyl pyrocarbonate treatment of the ternary complex of HLADH was also studied. The ratio between of NADH in equilibrium ternary complex of HLADH·coenzyme·substrate (alcohol: aldehyde) and the maximum quantity of NADH in active site of HLADH at various pH showed pH dependency. The observed pKa values of internal equilibrium with various substrates were 7.3(ethanol: acetaldehyde), 6.2 (2-chloroethanol: 2-chloroacetaldehyde) and 6.7 (anisalcohol: anisaldehyde). The absorbance at 328nm due to E·NADH·IBA(A^(IBA)_(328))was dependent on the PH value of the reaction. The observed maximum A^(IBA)_(328) from the equal concentration of HLADH was varied from substrate to substrate. The order was as follows: anisalcohol: anisaldehyde> benzyl alcohol: benzaldehyde > ethanol: acetaldehyde > 2-chloroethanol: 2-chloroacetaldehyde substrate pair. Inactivation rate of HLADH ternary complex from diethyl pyrocarbonate treatment showed pH dependency. The observed pkas were 7.7 (ethanol: acetaldehyde), 7.6(benzyl alcohol: benzaldehyde), 7.4 (2-chloroethanol: 2-chloroacetaldehyde) and 7.8(anisalcohol: anisaldehyde). The residual activity from diethyl-pyrocarbonate treatment also indicated similar pH dependency and pkas.