Cellulomonas속 종간 원형질 융합체의 특성

Abstract

Protoplasts of Cellulomonas flaviqena NCIB 12901 and Cellulomonas bibula NCIB 8142 were fused and regenerated, and characteristic of fusants obtained were investigated In order to give genetic maker, C. bibula was treated with 500 ㎍/ml NTG for 1 hr. and arginine requiring auxotrophic mutants were isolated. Protoplasts of the genus Cellulomonas were obtained by treatment with 600 ㎍/ml lysozyme, and 0.5 M sorbitol was optimal for osmotic stabilizer on protoplast formation. Protoplast fusion was enhanced by 40% PEG(M.W.6,000) containing 25 mM CaCl_(2) at 30˚C for 30 min. and fusion frequency between C. bibula and C. flavigena was 5X10^(-4). Processes of protoplast formation, cell wall regeneration and protoplast fusion were observed by scanning electron microscope. By comparing enzyme activities of cellulase, exocellobiohydrolase, β-glucosidase of the parent strains of Cellulomonas with that of their mutants and fusants, fusants with increased enzyme activity were obtained. By the studies on nutritional requirement, antibiotic resistance, cellulolytic enzyme activities, type of peptidoglycan and motility of two mutants and fusants, fusants were proved to be recombinant of both mutant strains.;섬유소를 분해할 수 있는 Cellulomonas flavigena NCIB 12901과 Cellulomonas bibula NCIB 8142의 종간 원형질체 융합을 하고 그로부터 얻은 융합체의 특성을 조사하였다. C. bibula는 유전자 표지를 부여하기 위해 돌연변이 유발원인 NTG(500㎍/㎖)를 1시간 처리하여 Arginine 요구성 변이주를 얻었다. Cellulomonas속의 원형질체는 lysozyme(600㎍/㎖)를 6시간 처리하여 얻었으며, 이때 삼투압 안정제로는 0.5 M Sorbitol이 최적이었고, 원형질체의 재생율은 6.7％였다. 원형질체 융합은 25mM CaCl_(2)를 포함하는 40% PEG(M.W. 6000)를 30℃에서 30분간 처리함으로 수행하였고, 영양 요구성 및 항생물질 내성을 유전자 표지로 하여 융합체를 선별하였다. C. bibula와 C. flavigena의 융합 빈도는 5×10^(-4)으로 원형질체의 형성 및 세포벽 재생과 융합 과정은 주사 전자 현미경으로 확인하였다. Cellulase exocellobiohydrolase, β-glucosidase 효소 활성이 아생형 균주나, 돌연변이주와 비교하여 증가된 융합체를 선별하였고, 모균주와 융합체의 세포벽 중 peptidoglycan을 추출 amino산 성분을 조사 비교하였다. 융합 균주의 영양 요구성, 항생물질 내성, 효소 활성, 세포벽 성분, 운동성 등을 비교하여 융합체는 모균주의 재조합체임을 밝히었다.