Pseudomonas syringae pv. phaseolicola로부터 제한효소의 분리정제 및 특성

Abstract

Pseudomonas syringae pv.phaseolicola로부터 새로운 제한효소 Psy Ⅰ을 분리하여 그 촉매적 특성에 관하여 조사하였다. 효소의 정제를 위하여 70g의 균체를 이용하였고, 300watt에서 6분간 (2분간 3번씩 얼음위에서 수행 sonication하여 마쇄하였다. 이것을 streptomycin sulfate침전, Ammonium sulfate 침전, Phosphocellulose pll, DEAE-cellulose, Hydroxyapatite, SephadexG-100 column chromatography를 통해 정제하여 순수한 단백질을 얻었다. 그 단백질 subunit의 분자량은 0.1%의 SDS를 포함하는 polyacrylamide gel에서 전기영동한 결과를 토대로 분석한 결과 약 50,000 dalton으로 추정된다. 이 효소의 촉매적 성질을 살펴보면, pH 7에서 pH 10 사이의 광범위한 pH 영역에서 안정하였고, 적정반응온도는 30℃에서 37℃였으며, 그 온도 안전성은 25℃에서 45℃사이로 나타났다. 이 효소는 20mM이상의 MgCl_(2), 25mM이상의 NaCl 에서 활성이 저해되었으며, 2-Mercaptoethanol 400mM까지 첨가시 계속 활성을 보였고, Ammonium sulfate는 10mM의 농도에서도 효소활성을 저해함을 볼 수 있었다. 플라스미드인 pBR 322와 PUC 18, 그리고 pBS등을 절단할 수 있었다. Lamda DNA를 여러종류의 제한효소로 절단하여 제한효소 지도를 작성하였다.;A novel restriction endonuclease, Psy Ⅰ, has been isolated from Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, and its catalytic properties have been studied. For the purification of this enzyme, 70g of cells were used and disrupted by sonicator at 300 watt for 6 min. After streptomycin sulfate and ammonium sulfate fractionation, Phosphocellulose P11, DEAE-cellose, Hydroxyapatite, Sephadex G-100 chromatography have been carried out. It's subunit molecular weight was about 50,000 dalton by polyacrylamide gel electrophoresis containing 0.1 % SDS. In catalytic properties, Psy I shows stable at wide range of pH between 7.0 and 10.0, in the presence of 10mM MgCl_(2). The optimum temperature of Psy I is between 30℃ and 37℃ and its thermal stability is between 25℃ and 45℃. Psy does not essentially require salt for enzyme reaction, rather is inhibited over 25mM NaCl and is ihibited over 20mM MgCl_(2). The presence of 2-Mercaptoethanol is absolutely required for enzyme reaction, but small quantities of Ammonium Sulfate(10mM) inhibit enzyme reaction. This enzyme digests plasmid pBR 322, pUC 18, pBS DNA. The restriction map of lamda DNA was made by double digestion of various enzymes.