스테롤로부터 1,4-Androstadiene-3, 17-dione을 생성하는 미생물의 분리, 동정 및 발효조건의 검토

Abstract

Microbiological conversion of sterols to 17-ketosteroids has been recognized as a source for commercial preparation of steroidal drugs. For the purpose of strain development, we isolated microorganisms through enrichment culture. We studied on the characteristics of the isolate strain and fermentation conditions for 17-ketosteroid production. The results were as follows. 1. The strain showed the following characteristics. shape : coccoid, Gram-positive, spore-nonformation, non-acid fast, growth : rod-coccoid cycle non-motile, catalase activity-positive, nitrate reduction-positive, non-acid formation from glucose, color of colony : light pink, Tm of DNA: 98.44℃ (Brevibacterium lipolyticum IAM 1398 Tm of DNA: 99.16℃), type of peptidoglycan amino acid: mesodiaminopimelic acid . Based on the above characteristics, the strain was tentatively designated to Brevibacterium erythrogenes. 2. The optimal substrate was cholesterol (0.1%) with Tween 80 (0.05%) as a surfactant. 3. Beef extract (0.5%) might be a substituent for yeast extract (0.5%) in the fermentation medium. Better production of ADD was manifested with the addition of beef extract (0.2%) to the fermentation medium. 4. α, α'-Dipyridyl(1 mM) was best for ADD production among various enzyme inhibitors tested. 5. The optimal time of inhibitor addition was 17-20 hours after inoculation. 6. Addition of bentonite (0.5%) increased ADD production.;한국의 토양으로부터 cholesterol을 이용하여 1, 4-androstadiene-3, 17-dione(ADD)을 생성할 수 있는 미생물을 분리하였으며 분리된 미생물을 동정하였고 ADB생성을 위한 배지성분 및 발효조건을 검토하였다. 1. Cholesterol을 함유하는 배지를 이용한 집적배양법(enrichment culture)을 통하여 α, α'- dipyridyl 존재에서 ADD를 생성할 수 있는 미생물을 토양시료로부터 분리, 선별하였다. 2. 분리된 균주에 대하여 형태학적, 생리학적, 배양학적 특성을 조사한 결과 균의 형태는 coccoid이며, 성장시 rod로 swelling된 후 rod의 fragmentation으로 coccoid가 되는rod-coccoid cycle로 증식됨을 볼 수 있었다. 세포벽의 Peptidoglycan amino acid로 meso-diaminopimelic acid를 가지고 있으며 Bre-vibacterium lipolyticum과 유사한 DNA의 Tm 및 특성들과 집락의 색깔로부터 Brevibacterium erythrogenes로 동정하였다. 3. 분리, 동정된 균주에 대한 기질 특이성, 최적 pH를 조사하고 탄소원, 질소원을 변경하거나 식물성기름, 흡착제 또는 계면활성제를 첨가하여 ADD생성력에 미치는 영향을 검토한 결과, 기질로는 cholesterol이 좋았으며, 배지의 pH는 7.4일 때가 적합하였다. 배지조성의 검토결과 beef extract은(0.5 %)가 yeast extract(0.5 %)를 대치할 수 있는 질소원임을 알 수 있었다. 또한 beef extract(0.2 %)를 발효배지에 더 첨가시 26.93 %의 conversion yield를 나타내어 대조실험에 비하여 ADD 생성이 증가함을 볼 수 있었다. 계면활성제를 첨가, 변경하고 ADD생성을 검토한 결과, Tween 80 0.05 %를 첨가하고 기질농도를 0.1 %로 하였을 때 20.81 %의 conversion yield로 가장 ADD생성이 높음을 볼 수 있었고 기질농도를 0.2 % 또는 0.3 %로 증가시켰을 때 ADD로의 전환수율이 저하함을 볼 수 있었다. 핵 분해효소저해제로는 α, α'-dipyridyl 1mM을 균접종후 17시간에서 20시간 사이에 첨가하는 것이 20 %이상의 conversion yield를 보여 적합하였다. 식물성기름이나 흡착제의 첨가는 대체로 ADD 생성을 감소시켰으나 bentonite 0.5%의 첨가는 25.6 %의 conversion yield를 나타내어 대조실험에 비하여 ADD생성이 증가함을 볼 수 있었다.