Bacillus속 균주에서의 Plasmid추출 방법의 비교검토와 검색

Abstract

단백질 산물을 체외로 분비하는 특징을 지녀 외래 유전자의 단백질을 생산하는데 이상적 숙주로 이용될 수 있는 Bacillus속 균주의 내재 plasmid DNA를 검색하기 위해 B.subtilis BD 366(pUB110)과 E.coli RD103 (pBR322)를 사용하여 ① Triton X-100-heating 법, ② SDS-alkaline lysis 법, ③ Boiling-phenol chloroform 법 등의 세 가지 rapid isolation 방법들을 검토하였다. 세 방법 모두 lysozyme으로 peptidoglycan 층을 제거하였고 방법 ①과 ③은 Triton X-100을, 방법 ②는 알칼리성 SDS를 첨가하여 용균시켰다. plasmid 이외의 물질제거는 방법 ①에서는 가열 후 곧 냉각하여 변성된 염색체 DNA를 원심분리하여 제거하였고 방법 ②에서는 염색체 DNA를 알칼리로 변성시키고 SDS와 단백질 복합체를 고농도의 염(3M NaAc)을 가하여 침전시킨 후 원심분리하여 제거하였다. 방법 ③에서는 끊여서 파괴시킨 세포잔해와 변성된 염색체 DNA를 원심분리해 버리고 단백질을 Phenol로 추출하여 제거하였다. plasmid의 최종 회수는 방법 ②에서는 isopropanol을 가하여, ①과 ③에서는 ethanol을 가하여 침전시켜 회수하였다. Bacillus의 pUB110은 방법 ①과 ②에 의해, E.coli의 pBR322는 방법 ①, ②, ③에 의해 모두 추출되었고 전기영동결과 pUB110은 방법 ②로, pBR322는 방법 ③으로 가장 효과적으로 추출됨을 확인 하였다. Bacillus속 균주에서의 Plasmid 검색방법으로 SDS-alkaline lysis법이 가장 효율적이므로 plasmid 검색시 추출방법으로 택하였다. SDS-alkaline lysis 법에 의해 B.subtilis BD 366에서 추출한 pUB110으로 B.subtilis RM 125, B.subtilis BD170 을 형질전환시킨 결과 neomycin 저항성 형질전환체를 얻었다. 총 106균주의 포자형성균을 대상으로 SDS-alkaline lysis법으로써 염색체외 DNA 검색을 실시한 결과 토양분리 포자형성균인 strain BSS-31에서 분자량이 작은 염색체의 DNA가 발견되었다. BSS-31은 neomycin과 kanamycin에 저항성을 나타내었으나 두 항생 물질에 의해 plasmid증폭은 되지 않았고 acridine 염료를 사용한 curing test 후에도 저항성은 소실되지 않아 plasmid성이 아님을 알 수 있었다. 메주분리 포자형성균 중 strain BSN-X에서도 염색체외 DNA가 나타났고 분자량은 pUB110이나 pBR322보다 훨씬 큰 DNA였으며 BSN-X는 항생물질 저항성을 전혀 나타내지 않았다. 두 미지 DNA들은 모두 시간이 경과됨에 따라 숙주로 부터 사라져 최초로 추출된 날로부터 BSS-31의 DNA는 103일, BSN-X의 DNA는 48일 이후에는 추출되지 않았다. SDS-alkaline lysis 법에 의해 Bacillus속에서 plasmid를 추출, 분리하는 방법을 확인하여 이 방법으로 야생주에서 염색체외 DNA의 추출을 시도하였으나 copy number가 불충분한 탓인지 검출, 분리하기엔 충분한 양이 발견되지 않았다. 따라서 새로운 plasmid의 발견에서 좀 더 효율적인 추출방법이나 혹은 plasmid를 증폭시킨 후 검출하는 방법의 고안이 필요한 것으로 판단되었다.;Because of the eminent ability to excrete protein product into the surrounding medium, Bacillus spp. can be used for ideal hosts to produce foreign gene protein. In order to screen for the indigenous plasmid DNA, in the first instance, three different rapid plasmid isolation methods were examined. They were 1Triton X-100 - heating method, 2 SDS -alkaline lysis method, and 3 Boiling - phenol/chloroform method Peptidoglycan layers were eliminated by lysozyme treatment in all cases and bacterial cells were lysed with addition of Triton X- 100 in method 1 and 3, and with alkaline SDS in method 2. To exclude cellular materials other than plasmid DNA, heat-denatured chromosomal DNA was centrifuged out in method 1, and alkali-denatured chromosomal DNA and SDS-protein complex were precipitated in the presence of 3M NaAc and centrifuged out in method 2. In method 3, cell debris and denatured chromosomal DNA remained after boiling were Centrifuged out and proteins were eliminated by phenol extraction. Plasmid precipitation was obtained by centrifugation in the presence of isopropanol in method 2 and in the presence of ethanol in method 1 and 3. PUB 110 was isolated by method 1 and 2 , and pBR322 was isolated by method 1, 2, and 3. With the intensities of fluorescence of DNA bands on agarose gel, method 2 was found to be the most effective one in the genus Bacillus, and selected for screening method. B. subtilis RM125 and B. subtilis BD170 were transformed with pUB11O isolated by SDS -alkaline lysis method and Neomycin-resistant transformants were obtained. Screening for extrachromosomal DNA was done against 106 strains of spore-forming bacteria and a small extrachromosomal DNA was detected in strain BSS-31. Strain BSS-31 revealed neomy-cin and kanamycin resistance but did not show plasmid amplification by them. After curing test with acridine dyes, the resistance did not lost and it was thought to be non-plasmid correlated trait. Strain BSN-X had an large extrachromosomal DNA and showed no antibiotic resistance. Two unidentified DNAs have disappeared with time. It was impossible to isolate the extrachromosomal DNA of strain BSS-31 from 103 days after the first detection, and from 48 days in the case of strain BSN-X. Perhaps the low copy no. of the plasmids makes it difficult to isolate and detect the plasmid DNA in the wild type spore-forming bacterial strains : More efficient isolation method or plasmid amplification method should be investigated.