한국 임산부의 풍진감염시 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction)을 이용한 선천성 풍진감염의산전진단

Abstract

Rubella viral infection in pregnant women is frequently transmitted to the fetus,resulting in the fetal damage. Fetal rubella infection have been diagnosed by detection of rubella sepcific IgM in fetal blood. However this has been limited because the fetal IgM is not developed before 22 weeks of gestation. In this study, 85 amnionic fluid and 30 fetal blood samples were obtained from 85 pregnant women, whose serum rubella IgM were positive. Viral RNA from clinical specimens was reverse transcribed and the produced cDNA was amplified by nested polymerase chain reaction (nested PCR) using a set of primers, the outer primer pair defining a 591bp sequence and the inner primer pair defining a 321 bp sequence within the former one. The results were as follows; 1. A reverse transcription nested PCR by detection of RNA extracted from 10^-1 50% tissure culture infective dose of live attenuated rubella vaccine was sensitive method. The identify of PCR product were verified by direct sequencing using fluorescent dideoxy-termination to confirm the target sequence. 2. RT-PCR detected rubella virus RNA in bloods from 4 children who were confirmed rubella infection serologically. 3. Rubella virus was detected from 2 of 15 products of conceptus which was obtained from pregnant women with rubella specific IgM. 4. Among 85 pregnant women, there were typical skin rashes in 15 cases(18%). 5. In only one case of 55 amnionic fluid obtained in 13-19 weeks of gestation from pregnant women with rubella specific IgM, rubella PCR was positive. 6. Rubella virus was detected by RT-PCR in only 1 case among 30 fetal blood obtained by cordocentesis from another pregnant women with rubella specific IgM. But, in one case, the results were not concordent, that is, PCR was negative and rubella specific IgM was positive in fetal blood obtained in 22 weeks of gestation. 7. There was no statistical significance between maternal clinical symptoms, such as rashes and incidence of fetal infection. 8. Among delivered 56 neonates whose prenatal rubella PCR and IgM results were negative, 3 neonates showed positive for postnatal rubella specific IgM, but showed no congenital rubella up to 8 - 9 months follow up. 9. Among total 85 cases, presently 19 were ongoing prenancy, 56 went to term and resulted in healthy babies except 2 anomaly with unrelated congenital rubella infection, while 19 pregnancies are progressing normally and 4 were failed to follow up and one was preterm birth and 5 were electively terminated. 10. Incidence of congenital rubella infectin which was diagnosed prenatally or postnatally was relatively low, 7%(6/85). In conclusion, PCR for rubella virus was earlier, faster and more accurate method for detection of fetal rubella infection in amnionic fluid and/or fetal blood than rubella specific IgM in fetal blood, when specific IgM was positive in early pregnant women. Appropriate detection for fetal rubella infection should by carried out by direct etiologic diagnosis such as PCR. This method will become an valuable approach to provide prenatal counselling following rubella virus infection for prevention of unnecessary termination of pregnancy. ; 풍진은 Toga viridae의 Rubivirus에 속하는 RNA 바이러스의 감염에 의한 비교적 급성감염증이나 임상증상은 경증의 경과를 보이는 바이러스 질환이다. 임신 초기의 산모에서 풍진 감염시 태아의 만성 풍진 바이러스 감염으로 인한 치명적인 다발성 기형인 선천성 풍진증후군을 초래할 수 있다. 풍진에 대한 감수성이 있는 임신부가 풍진과 비슷한 증상을 나타내거나 풍진환자와 접촉한 경우, 산모혈청검사에서 풍진특이 IgM이 양성인 경우에 태아 감염여부를 진단하는 것은 쉽지 않다. 산모의 풍진 감염 여부는 산모 혈청의 풍진특이 IgM 항체검사에 의하며, 임신초기에 풍진특이 IgM항체가 양성이면 태아의 감염여부를 우려하여 치료적 임신중절까지도 고려하게 된다. 그러나 풍진특이 IgM은 최근의 감염을 의미하기는 하지만 위양성의 가능성이 있어며, 산모의 풍진감염이 곧 태아의 감염을 의미하는 것은 아니므로 태아의 감염을 알아보기 위한 여러 방법들이 시도되어 왔다. 융모막 융모나 양수 등에서 바이러스를 분리 및 동정하는 방법이 있으나, 검사방법이 복잡하고 결과가 나오기까지 많은 시간을 요하는 단점이 있다. 태아의 혈액을 채취하여 풍진특이 IgM을 측정하는 방법은 최소한 임신 22주가 되어서야 검사의 신뢰성이 있으며 위음성 결과를 보일 수 있다. 최근에 분자생물학기법의 발달에 의해 역전사반응(reverse transcription)시킨 후 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; 이하 PCR)을 이용하여 적은 양의 바이러스로도 이를 증폭하여 빠르고 정확하게 진단하는 새로운 연구들이 소개되고 있다. 태반조직이나 임신중절 후의 임신산물(products of conceptus)에서 PCR에 의해 태아의 풍진감염여부의 진단을 시도한 여러 연구들이 발표되었고 많은 진전이 있어 왔다. 그러나 이러한 발전에도 불구하고 풍진감염의 산전진단의 연구가 임상에 적용되지는 못하고 있는 실정이며, 따라서 본 연구에서는 임신 중 풍진감염이 의심되는 산모 85례를 대상으로 태아의 풍진 감염여부를 진단하기 위한 PCR검사의 정확도를 알아보고자 하였다. 1994년 1월부터 1997년 2월까지 풍진특이 IgM 항체가 양성인 산모를 대상으로 풍진감염이 의심되어 임신중절을 시행한 15례의 임신산물과 산전진단을 시행한 산모 85례를 대상으로 하였다. 양수천자술을 시행하여 양수에서 풍진 바이러스 RNA검출을 위한 PCR을 시행하였고, 늦게 내원한 경우에는 태아혈액채취를 병행하여 풍진바이러스 RNA검출을 위한 PCR과 풍진특이 IgM검사를 하였다. PCR방법은 RNA를 추출한 후 이를 역전사반응시킨 후 cDNA를 얻어 viral E1 gene의 591bp sequence를 한정하는 outer primer pair와 그 안쪽으로 321bp sequence를 한정하는 inner primer pair를 이용하여 nested PCR을 시행하였다. 산전진단의 결과를 확인하기 위해 분만시에 제대혈액으로 다시 PCR과 IgM검사를 시행하였고, 신생아의 평가 및 소아과 추적검사를 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 약독화된 풍진 생백신(live attenuated rubella virus vaccine)을 positive control로 하여 PCR을 시행하였다. Rul과 Ru4 primer로 시행한 PCR로 591bp의 밴드의 product를 얻었고, Ru2와 Ru3 primer로 시행한 nested PCR에서는 321bp의 product를 얻었다. PCR에서 양성결과를 보인 경우의 PCR product로 시행한 sequencing결과 모두에서 기존 발표된 풍진 바이러스의 염기서열과 일치하였다. PCR을 시행하여 약독화된 풍진생백신을 10^-4까지 희석한 농도 즉 10^-1 TCID_50에서 321bp의 밴드가 쉽게 잘 보여 매우 적은 양의 바이러스까지 검출할 수 있음을 알 수 있었다. 2. 4례의 IgM이 양성인 풍진을 앓고 있는 소아의 혈액을 이용한 PCR결과 모두에서 321bp의 밴드를 확인할 수 있었다. 3. PCR을 산전진단에 적용하기 전에 풍진감염의 우려로 소파술을 시행한 임신산물 15례에 PCR을 검사한 결과 단지 2례에서만 양성결과를 보였다. 4. 산전진단이 시행되었던 85례의 산모 중 풍진 특이 발진이 있었던 경우는 15례(18%)였다. 산모가 풍진에 감염된 시기는 임신 14주이하인 경우가 54례로 64%였다. 5. 임신 13주에서 19주 사이에 양수천자술이 시행된 55례 중 단지 1례에서 PCR에 의한 풍진바이러스RNA가 검출되었다. 6. 제대천자술(cordocentesis)을 시도한 30례에서 양수와 태아혈액으로 시행한 PCR결과는 모두에서 일치하였다. 30례의 태아혈액 중 1례에서 PCR결과와 IgM결과가 양성이었다. 그러나 1례에서는 양수와 태아혈액의 PCR결과는 음성이나 태아혈액에서의 풍진특이 IgM은 양성으로 결과가 일치하지 않았다. 7. PCR로는 증상이 있었던 15례 중 1례(6.7%)가 양성이었고 증상이 없었던 70례 중에서는 1례(1.4%)에서 양성이었다. 태아혈액으로 풍진특이 IgM이 측정되었던 경우 증상이 있었던 12례 중 2례(1.7%)에서 양성결과를 보였고, 증상이 없었던 18례에서는 모두 음성결과를 보여, 증상의 유무와 태아감염의 빈도와의 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 8. 임신만기에 분만된 56례 중 3례의 산모에서 제대천자술에 의한 산전검사에서는 음성결과를 보였으나 분만시 검사한 풍진특이 IgM은 양성결과를 보였으며 현재 각각 8,8,7개월까지의 신생아 추적검사에서 선천성 풍진증후군의 증거는 보이지 않고 있다. 9. 85례의 태아 중에서 4례에서는 추적조사가 실패하여 81례에서만 임신성과를 알 수 있었다. 현재까지 19례가 임신을 지속하고 있으며, 5례에서는 임신중절을 하였으며, 1례에서는 조산되었고, 2례에서는 선청성 풍진증후군과 관련이 없는 기형이 있었다. 그러나 PCR검사에서 음성을 보였던 54례에서는 모두 건강한 태아를 출산하였으며 신생아 추적검사를 시행하였으나 선천성 풍진증후군의 증거를 보이지 않아 PCR의 위음성결과는 없음을 알 수 있었다. 10. 풍진특이 IgM이 양성인 산모에서 산전 또는 산후에 선천성 풍진감염의 빈도는 85례 중 6례(7%)로 비교적 낮았다. 결론적으로 임신초기 산모의 풍진특이 IgM항체가 양성일 때 본 연구의 선천성 풍진감염의 산전진단 후의 결과에 비추어 볼때, 양수나 태아혈액으로 태아의 풍진감염여부을 진단하기 위한 PCR은 풍진특이 IgM검사에 비해 비교적 임신 초기에도 검사가 가능하고 빠르며 정확한 방법이었다. 그러므로 임신초기에 산모의 풍진감염이 의심될 때 산모의 혈청검사 결과만으로 임신중절을 고려하기보다는 양수검사나 제대천자술을 시행하여 태아의 풍진감염여부를 더욱 정확하게 알 수 있는 PCR 검사를 반드시 고려하여야 하며 추후 이에 관한 더 많은 연구가 필요하리라고 생각된다.