포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 키토산의 항균성

Abstract

본 연구는 원료가 풍부하고 인체에 독성이 없으면서도 다양한 미생물에 대해 항균성을 나타내는 것으로 알려지고 있는 키토산을 직물의 항균가공에 응용하기위한 기초연구로서, 인체의 피부나 직물에 흔히 서식하는 화농균의 일종인 포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 키토산의 항균성 시험 조건을 확립하고 몇가지 키토산들의 항균 활성을 조사하여 키토산의 항균 특성을 비교 검토하였다. 본 실험에서는 시중에서 구입한 1종류와 본 실험실에서 제조한 6종류 등 모두 7가지 키토산 시료에 대해 항균성을 조사하였다. 용해성으로 분류하면 물에 불용성이고 산에 가용성인 것 5가지와 수용성인 것 2가지였다. 물에 불용성인 키토산은 점도가 4, 8, 50, 930cps인 4가지로 탈아세틸화도는 86%∼92% 범위였다. 시중에서 구입한 키토산도 불용성이며 탈아세틸화도는 76%였다. 수용성 키토산은 분자량이 1,000인 것과 3,000인 것 2가지였다. 균주는 한국유전공학연구소에서 분양 받은 KCTC 1916을 사용하였다. 키토산의 항균성은 키토산용액과 배양균액을 일정 비율로 혼합하여 일정 시간동안 접촉시킨 다음 이 혼합액의 일부를 평판 배양하여 계수한 콜로니수로부터 균밀도를 계산하여 평가하였다. 항균성 시험 조건의 적정화를 위해 균의 생육에 영향을 주는 요인은 6가지를 검토하였다. 키토산용액과 배양균의 혼합 비율에 따라 키토산에 의한 감균률이 다른 값을 나타냈지만 혼합비 1 : 9 에서 9 : 1 범위내에서 키토산의 항균활성을 평가하는 데에는 문제가 없었다. 키토산을 녹이는데 사용한 초산은 균의 생육을 억제하는 것으로 나타났다. 그러나 키토산의 항균활성을 초산 대조구에 대한 감균율에 의해 평가함으로써 초산의 영향을 배제할 수 있었다. 키토산-균 혼합액의 초기 pH는 4.0에서 6.5로 높아질수록 키토산의 항균활성도 높게 나타났다. 키토산-균 혼합액에서 키토산과 균의 접촉시간이 24시간까지 길어질수록 감균율도 커졌다. 그러나 접촉시간을 짧게 해도 키토산의 항균성을 평가하는 데는 문제가 없었다. 키토산-균 혼합액의 초기 균농도는 2.3×10^6 /ml 이내에서는 키토산에 의한 감균율에 영향을 주지 않았다. 키토산을 처리한 용액의 균수를 측정하기 위한 평판배양시간은 키토산용액의 항균활성에 따라 차이가 있으나 24∼72시간이 적당하였다. 본 실험에서는 시중에서 구입한 1가지와 본 실험실에서 제조한 6가지 등 모두 7가지 키토산 시료에 대해 항균성을 조사하였는데 수용성 키토산 2가지를 제외한 4가지 키토산 모두 시중에서 구입한 것 보다 항균활성이 4배 이상 높게 나타났다. 항균활성이 있는 이들 4가지 키토산의 경우에 키토산농도 0.1% 수준에서 대조구(초산용액)에 대한 감균율이 72%∼87% 였다. 수용성키토산과 산에 가용성이지만 물에 불용성인 키토산(불용성 키토산)의 항균활성을 비교한 결과 후자는 항균활성이 있었으나 수용성 키토산은 항균활성이 없었다. 분자량이 1,000과 3,000인 두 종류의 수용성 키토산은 초산을 함유하는 배지에서 오히려 균의 생육을 촉진시키는 것으로 나타났는데, 균생육촉진효과는 분자량 1,000인 것이 높았다. 불용성 키토산의 경우 시중에서 구입한 키토산에 비해 본 실험실에서 제조한 키토산이 약 4배 정도 항균활성이 높았다. 탈아세틸화 정도에 따라 키토산의 항균력은 다르게 나타났는데 76%-탈아세틸 키토산의 감균률이 17%, 86%-탈아세틸 키토산이 56%로 탈아세틸화도가 큰 키토산의 항균활성이 높았다. 점도 4, 8, 50, 930 cps의 4가지 키토산에 대해 항균활성을 조사 비교한 결과 분자량과 항균활성 간에는 상관 관계가 없는 것으로 나타났다. 항균활성을 나타낸 키토산 4가지 중에서 대표적으로 4 cps, 86%-탈아세틸 키토산의 항균특성을 조사하였다. 키토산 농도 0.0125%에서 감균률 29%를 보여 매우 낮은 농도에서도 활성을 나타내었으며, 키토산 농도 0.2%에서는 감균율이 98%나 되었다. 키토산-균 혼합액의 초산농도가 낮을 때 더 높은 항균활성을 보였고, 혼합액의 초기 pH는 4에서 6 범위내에서 높을수록 항균활성이 증가하였다. 키토산농도 0.025% 이상에서는 균과의 접촉시간 4시간 이내에 100%의 감균율을 나타냈고, 혼합액의 초기 균농도 2.3x10^6 /ml 이내에서는 90% 이상의 감균율을 나타냈다. 이러한 결과로 미루어 볼 때 본 실험실에서 제조한 4가지 키토산은 우수한 항균성을 가지고 있어서 직물의 항균가공제로서 매우 가치가 큰 것으로 판단되었다. ; The experimental conditions for evaluating antibacterial activities of chitosans were established. The antibacterial activities of several types of chitosan were measured against Staphylococcus aureus and evaluated for their application to antibacterial textile finishing. Seven types of chitosan samples were prepared in our laboratory except one which purchased from the market. Among the seven, the two were soluble in water and the others were insoluble in water but soluble in diluted acids. The molecular weights of the two water-soluble chitosans were 1.000 and 3,000. The molecular weights of the four water-insoluble chitosan were 4, 8, 50 and 930 cps, respectively and their degrees of deacetylation were between 76 and 92%. The strain of Staphylococcus aureus used in this experiments was KCTC 1916 purchased from Korean Genetic Engineering Research Institute. The antibacterial activities of chitosans were estimated from the bacterial densities or % reduction of bacteria in the mixtures of chitosan solutions and bacterial culture after incubation under the specific condition. The six parameters were evaluated to optimize the experimental conditions for measuring antibacterial activities. The three types of combination by volume of the chitosan solutions with bacterial cultures gave different antibacterial activities of the mixtures. However, the antibacterial activities of chitosans could be evaluated by comparing the data obtained under the same specific combination. The solvent, acetic acid, used for dissolving chitosan inhibitted bacterial growth. The influence by the solvent itself on antibacterial activities of chitosan solutions could be eliminated by using % reduction of bacteria compared to the control solution containing the same specific concentration of acetic acid. The initial pH of the chitosan-bacterial mixtures also affected antibacterial activity of chitosan, the higher activity in terms of % reduction of bacteria was observed at the higher pH. In case of the bacterial solution without either acetic acid or chitosan, the initial pH of the solution did not significantly affect bacterial growth. The % reduction of bacteria was increased with extending contact times of bacteria with chitosan in the chitosan-bacterial mixture up to 24 hours. However, the antibacterial activities of chitosans could be successfully evaluated at the shorter contact time including contact time 0 where the chitosan-bacterial mixture was plated immediately after mixing and incubated for measuring the bacterial number. The inoculated bacterial concentration up to 2.3×10^6/ml did not change the % reduction of bacteria in test mixtures after incubation. The optimal range of incubation time of the petridish after plating the chitosan-bacterial mixture was 24 to 72 hours dependig on antibacterial activities of the test solutions. The chitosans prepared in our laboratory showed high antibacterial activities except the two water-soluble chitosans. Activities of the four chitosans were four times or higher compared to that of chitosan purchased from the market. The % reduction in bacterial density of the above chitosan solution compared to the control solution of acetic acid were between 72 and 87%. The two water-soluble chitosans with molecular weights 1,000 and 3,000 did not show antibacterial activities. These chitosans seemed to promote bacterial growth in the presence of acetic acid rather than to inhibit bacterial growth. The chitosan with molecular weight 1,000 showed higher promoting activity on the bacterial growth than the chitosan with molecular weight 3,000 did. The deacetylation of chitosan was appeared to increase antibacterial activity. The % reduction in bacterial density of the 86%-deacetylated chitosan solution was 56% where that of the 86%-deacetylated chitosan solution was only 17%. Molecular weights of the chitosans seemed not to affect antibacterial activities of chitosans because the four chitosans with 4, 8, 50, 930 cps did not show any linear increase or decrease in antibacterial activity with the increase of molecular weight. The antibacterial activity of the acid-soluble, 86%-deacetylated chitosan with 4 cps was intensively studied here as a representative sample of the active chitosans prepared in our laboratory. This chitosan showed 29% of the % reduction of bacteria compared to acetic acid control even at the level of 0.0125% chitosan, and 98% of the % reduction at the level of 0.2% chitosan. The % reduction of bacteria of this chitosan was higher at the higher concentration of actic acid in the chitosan-bacterial mixture. The antibacterial activity was increased with the pH change over the range of 4.0 to 6.5. The 100% of the % reduction of bacteria was achieved within 4 hour incubation of the chitosan-bacterial mixture. However the regrowth of bacteria was observed when extended incubation time of the chitosan-bacterial mixture longer than 72 hours. This result supported the idea that chitosan might act as a bacteriostatic rather than as a bactericide. According to the data obtained from the above experiments, the four chitosans among the six prepared in our laboratory were proved to be valuable for antibacterial textile finishing.